微波提取高效液相色谱法测定花椰菜中的维生素C

摘要：研究微波辅助提取、反相高效液相色谱法测定花椰菜中维生素C含量的方法。将花椰菜匀浆后，以1%草酸为萃取剂，微波提取、净化后，采用恒流的方法进行液相色谱定量检测，以0.1%草酸溶液为流动相，流速 1.0 mL/min，采用C18反相色谱柱分离，在254 nm波长下检测。结果表明，维生素C浓度在0.02～0.12 mg/mL范围内线性良好，相关系数为0.999 6，检测限0.02 mg/kg，回收率在99.9%～104.6%之间，相对标准偏差为1.20%。说明微波辅助法、反相高效液相色谱法能有效提取蔬菜中的维生素C，且测定结果稳定、重现性好，可以用于蔬菜中维生素C的检测。

关键词：微波提取；高效液相色谱法；花椰菜；维生素C

中图分类号： O657.7+2 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0256-02

收稿日期：2013-08-07

基金项目：江苏省南通市农村科技创新及产业化项目（编号：HL2012025）。

作者简介：吴海燕（1978—），女，江苏南通人，硕士，讲师，主要从事食品综合利用、食品安全检测研究。Tel：（0513）81050523；E-mail：why022@126.com。维生素C别称抗坏血酸，是维持人体正常生理代谢不可缺少的一类有机化合物，人体自身不能合成，必须由膳食供给，维生素C广泛存在于新鲜的水果、蔬菜中[1]。花椰菜是十字花科芸薹属植物，营养丰富，富含蛋白质、食物纤维、维生素等。有研究表明，花椰菜中含有丰富的维生素C，长期食用能提高人体的免疫功能，促进肝脏解毒；同时也能起到阻止癌前病变细胞形成的作用，从而可以从一定程度上预防癌症[2]。维生素C含量的测定方法通常有以氧化还原为基础的比色法或者以衍生反应为基础的荧光法[3]，但是这些方法所需的试剂多且操作复杂。由于维生素C有较强的还原作用，在处理时容易使样品中的维生素C损失，从而影响测定的准确度和精确度。高效液相色谱法具有高效、稳定、可靠等特点，特别是在待测样品较多的情况下，借助仪器分析能更快更准确地进行维生素C含量的测定。近年来已有一些报道用高效液相色谱法测定维生素C的含量[4-6]，但是在样品制备过程中存在提取率低、操作繁琐、萃取剂用量大等问题。微波提取是一种较新的样品前处理方法，与传统的提取法相比，其最大的优点是提取的产品杂质含量低、有效成分含量高且提取效率高[7]，目前这种新的微波提取技术已逐渐被应用于天然植物有效成分、生物活性成分的提取研究中[8-12]。本研究以期建立微波提取、反相高效液相色谱法测定花椰菜中维生素C含量的方法，为花椰菜中维生素C的含量测定提供试验资料。

1材料与方法

1.1主要试剂与材料

主要试剂为：甲醇，色谱纯；维生素C、草酸等试剂，国产分析纯；所有试验用水均为超纯水。主要试验材料为：0.45 μm 滤膜，国药集团化学试剂有限公司；花椰菜，市售。

1.2主要仪器与设备

试验用主要仪器与设备有Waters高效液相色谱仪、Waters1525泵、Waters2487紫外检测器、Breeze色谱系统管理工作站、液相平头微量进样器（Eppendorf）、HR2084食品制样器（飞利浦）、CW-2000A型超声-微波协同萃取仪（上海新拓）、Millipore超纯水机、隔膜真空泵（天津腾达）、TU-1901紫外可见分光光度计（北京通用普析）、KQ3200超声脱气机（昆山市超声仪器有限公司）、Symmetry C18色谱柱。

1.3试验方法

1.3.1色谱条件Symmetry C18色谱柱柱长100 mm，内径 4.6 mm，颗粒大小5.0 μm，检测波长254 nm，流动相为0.1% （体积分数）草酸溶液，流速1 mL/min，进样量25 μL，柱温 25 ℃；以保留时间定性，待液相色谱稳定后进样分析，以峰面积外标法定量。

1.3.2样品处理称取100 g花椰菜样品，迅速切碎后置于食品制样器中，加入100 mL 2%草酸溶液制成匀浆。准确称取5.00 g匀浆样品，以30 mL 1%草酸为萃取溶剂，微波功率设为200 W，萃取时间为15 min，萃取温度设定为45 ℃，平行萃取2次[6]。萃取液过滤后，用1%草酸溶液定容至50 mL制成待测液。待测液用0.45 μm滤膜过滤后按“1.3.1”节色谱条件进行HPLC测定。

1.3.3线性关系分析维生素C标准溶液的制备：准确称取20 mg维生素C对照品，用0.1%草酸溶解后转移至 100 mL 棕色容量瓶中，定容并制成维生素C标准储备液。再分别准确量取1、2、3、4、5、6 mL维生素C标准储备液于 10 mL 棕色容量瓶中，用0.1%草酸溶解并定容，分别制成浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL的系列标准维生素C标准溶液，用0.45 μm滤膜过滤后按“1.3.1”节色谱条件进行HPLC测定。每个浓度进样3次，以平均峰面积的积分值对进样浓度（mg/mL）进行直线回归。

1.3.4精密度试验取所制得样品，按照“1.3.1”节色谱条件重复进样6次，测定维生素C的精密度。

1.3.5回收率试验采用加样回收法，精密称取适量匀浆样品，加入维生素C标准品，按“1.3.2”节方法进行处理，按含量测定方法测定维生素C的回收率。

1.3.6最低检测限的计算以产生3倍仪器噪声水平的进样量为检出限[13]。

2结果与分析

2.1色谱分离结果

液相色谱分离效果的主要影响因素为色谱柱的类别、流动相、流速。在“1.3.1”的色谱条件下，维生素C标准品溶液、花椰菜样品的色谱图分别见图1、图2，可以看出所有样品均能实现基线分离，而且峰形能满足测定要求，维生素C的保留时间为2.868 min，检测限为0.02 mg/kg。endprint

2.2标准工作曲线

以3次进样的平均峰面积为响应值，以维生素C标准品的进样浓度（mg/mL）为自变量，求得直线回归方程为：y=876 060x+2 750.9，r2=0.999 6，标准曲线在0.02～0.12 mg/mL 范围内线性良好。

2.3精密度试验

将同一花椰菜样品按照“1.3.1”中的色谱条件重复进样6次，测得花椰菜中维生素C的含量分别为632.0、637.7、635.2、650.8、641.8、649.5 mg/kg，平均含量为641.2 mg/kg，本测定试验的相对标准偏差为1.20%，表明本方法的精密度高，重现性较好。

2.4回收率试验

分别称取3份5.00 g匀浆的花椰菜样品，分别加入1、2、5 mL的0.20 mg/mL维生素C标准液，按“1.3.2”节方法提取，按“1.3.1”节的色谱条件测定维生素C含量，每个混合样品测定3次，取平均值。结果（表1）表明，3个不同添加量试样的回收率在99.9%～104.6%之间，平均回收率102.4%，表明采用微波提取、反相高效液相色谱法测定花椰菜中维生素C含量的方法准确度好，符合色谱定量分析的准确度要求。

3结论

本试验采用微波辅助提取，过滤后用液相测定方法来测定花椰菜中维生素C含量。结果表明，本方法的线性范围为0.02～0.12 mg/mL，检测限0.02 mg/kg，回收率在99.9%～104.6%之间，平均回收率为102.4%，相对标准偏差为120%。由于维生素C性质不稳定，易氧化，采用微波辅助提取，不但加快了提取进程，缩短了样品制备时间，避免维生素C的损失，同时有效提取样品中的维生素C，测定的准确度和精密度好，可用于蔬菜中维生素C含量的定量测定。

参考文献：

[1]刘胜辉，臧小平，魏长宾. 番石榴中VC的高效液相色谱分析[J]. 食品科学，2007，28（4）：292-295.

[2]第二军医大学药学系.中国药用植物图鉴[M]. 上海：上海教育出版社，1960：731.

[3]GB/T 5009.86—2003蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定（荧光法和2，4-二硝基苯肼法）[S]. 北京：中国标准出版社，2003.

[4]裴云逸. 高效液相色谱法快速测定蔬菜中VC含量的研究[J]. 食品与机械，2012，28（5）：91-93，162.

[5]吴晓娜，黄承钰，孙爱民，等. 用高效液相色谱（HPLC）法测定血清维生素C含量[J]. 营养学报，2002，24（3）：301-303.

[6]张晋芬，袁冰，冷平，等. 梨，苹果和香蕉中8种多酚类物质的微波提取与高效液相色谱法测定[J]. 分析测试学报，2008，27（12）：1371-1374，1378.

[7]范华均，栾伟，李攻科. 微波辅助提取/HPLC分析石蒜中的生物碱[J]. 分析测试学报，2006，25（03）：27-30.

[8]Pérez-Serradilla J A，Japón-Luján R，de Castro M D L. Simultaneous microwave-assisted solid-liquid extraction of polar and nonpolar compounds from alperujo[J]. Analytica Chimica Acta，2007，602（1）：82-88.

[9]Liazid A，Palma M，Brigui J，et al. Investigation on phenolic compounds stability during microwave-assisted extraction[J]. Journal of Chromatography a，2007，1140（1-2）：29-34.

[10]严娟，蔡志翔，张斌斌，等. 桃果肉总酚提取和测定方法的研究[J]. 江苏农业学报，2013，29（3）：642-647.

[11]Mandal V，Mohan Y，Hemalatha S. Microwave assisted extraction-an innovative and promising extraction tool for medicinal plant research[J]. Pharmacognosy Reviews，2007，1（1）：7-18.

[12]蒋彦婕，吴纪中，张巧凤，等. 紫小麦麸皮花色苷提取工艺及其结构[J]. 江苏农业学报，2012，28（5）：1146-1151.

[13]吴海燕，陈建军.蔬菜中多种有机磷农药残留气相色谱分析法[J]. 食品与机械，2010，26（4）：76-77，83.endprint

2.2标准工作曲线

以3次进样的平均峰面积为响应值，以维生素C标准品的进样浓度（mg/mL）为自变量，求得直线回归方程为：y=876 060x+2 750.9，r2=0.999 6，标准曲线在0.02～0.12 mg/mL 范围内线性良好。

2.3精密度试验

将同一花椰菜样品按照“1.3.1”中的色谱条件重复进样6次，测得花椰菜中维生素C的含量分别为632.0、637.7、635.2、650.8、641.8、649.5 mg/kg，平均含量为641.2 mg/kg，本测定试验的相对标准偏差为1.20%，表明本方法的精密度高，重现性较好。

2.4回收率试验

分别称取3份5.00 g匀浆的花椰菜样品，分别加入1、2、5 mL的0.20 mg/mL维生素C标准液，按“1.3.2”节方法提取，按“1.3.1”节的色谱条件测定维生素C含量，每个混合样品测定3次，取平均值。结果（表1）表明，3个不同添加量试样的回收率在99.9%～104.6%之间，平均回收率102.4%，表明采用微波提取、反相高效液相色谱法测定花椰菜中维生素C含量的方法准确度好，符合色谱定量分析的准确度要求。

3结论

本试验采用微波辅助提取，过滤后用液相测定方法来测定花椰菜中维生素C含量。结果表明，本方法的线性范围为0.02～0.12 mg/mL，检测限0.02 mg/kg，回收率在99.9%～104.6%之间，平均回收率为102.4%，相对标准偏差为120%。由于维生素C性质不稳定，易氧化，采用微波辅助提取，不但加快了提取进程，缩短了样品制备时间，避免维生素C的损失，同时有效提取样品中的维生素C，测定的准确度和精密度好，可用于蔬菜中维生素C含量的定量测定。

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以3次进样的平均峰面积为响应值，以维生素C标准品的进样浓度（mg/mL）为自变量，求得直线回归方程为：y=876 060x+2 750.9，r2=0.999 6，标准曲线在0.02～0.12 mg/mL 范围内线性良好。

2.3精密度试验

将同一花椰菜样品按照“1.3.1”中的色谱条件重复进样6次，测得花椰菜中维生素C的含量分别为632.0、637.7、635.2、650.8、641.8、649.5 mg/kg，平均含量为641.2 mg/kg，本测定试验的相对标准偏差为1.20%，表明本方法的精密度高，重现性较好。

2.4回收率试验

分别称取3份5.00 g匀浆的花椰菜样品，分别加入1、2、5 mL的0.20 mg/mL维生素C标准液，按“1.3.2”节方法提取，按“1.3.1”节的色谱条件测定维生素C含量，每个混合样品测定3次，取平均值。结果（表1）表明，3个不同添加量试样的回收率在99.9%～104.6%之间，平均回收率102.4%，表明采用微波提取、反相高效液相色谱法测定花椰菜中维生素C含量的方法准确度好，符合色谱定量分析的准确度要求。

3结论

本试验采用微波辅助提取，过滤后用液相测定方法来测定花椰菜中维生素C含量。结果表明，本方法的线性范围为0.02～0.12 mg/mL，检测限0.02 mg/kg，回收率在99.9%～104.6%之间，平均回收率为102.4%，相对标准偏差为120%。由于维生素C性质不稳定，易氧化，采用微波辅助提取，不但加快了提取进程，缩短了样品制备时间，避免维生素C的损失，同时有效提取样品中的维生素C，测定的准确度和精密度好，可用于蔬菜中维生素C含量的定量测定。

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[13]吴海燕，陈建军.蔬菜中多种有机磷农药残留气相色谱分析法[J]. 食品与机械，2010，26（4）：76-77，83.endprint