互花米草NHX1基因的cDNA全长克隆、序列信息及定量表达分析

徐璐��+尹海波��+张侠��+曹雪霖��+卢楠楠��+闫丽华��陈世华��郭善利

摘要：以盐生植物互花米草（Spartina alterniflora）为试验材料，利用RACE技术克隆到编码Na+/H+逆向转运蛋白的[WTBX][STBX]NHX1[WTBZ][STBZ]基因的cDNA全长序列。利用生物信息学软件及网站对获得的基因核苷酸序列及编码的蛋白质序列进行分析，结果发现该核苷酸序列长度为2 277 bp，开放阅读框为1 623 bp，编码540个氨基酸残基，且该基因所编码的蛋白质与植物的Na+/H+逆向转运蛋白NHX1 同源，所以命名为[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因。同时氨基酸序列比对显示，其与芦苇（Phragmites australis NHX，BAD95562.1）、玉米（Zea mays NHX，XP_008653443.1）、水稻（Oryza sativa NHX，BAA83337.1）等的NHX亲缘关系相近，同源相似性依次为94%、92%、91%。利用Qiagene Rotor Gene Q荧光实时定量PCR仪对不同时间盐处理及ABA处理的互花米草材料进行荧光定量PCR检测。结果发现，在盐处理及ABA处理的不同处理时期，该基因的相对表达量都发生了明显的变化，这表明该基因受到了盐胁迫及ABA胁迫的诱导，由此可以看出[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因与植物的耐盐性有着密切的关系。

关键词：耐盐性；互花米草；[WTBX][STBX]NHX1[WTBZ][STBZ]基因；相对定量表达

中图分类号： Q785；Q786文献标志码：

随着土壤盐碱化面积的不断增加，植物面临着越来越严峻的高盐挑战。土壤中高浓度的盐分会给植物带来生理干旱、离子毒害等多种危害，严重影响到植物的正常生长发育，从而抑制农作物的高产。对于大部分植物来说，高盐胁迫对植物的危害主要是由高浓度的Na+积累所导致的。雖然不同植物的耐盐机制存在差异，但是其基本策略都是保持胞内Na+的平衡[1]。其中，植物体内的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（vacuolar Na+/H+antiporter）在植物抗盐碱的过程中起着至关重要的作用，它可以将细胞质中过多的Na）隶属禾本科米草属，是典型高度耐盐的泌盐盐生植物。它起源于美洲大西洋沿岸和墨西哥湾，适宜生活于潮间带，同时具有很好的耐淹、抗风浪能力。它体内也存在着一类Na+/H+逆向转运蛋白，以此来减轻Na+毒害。因此，互花米草材料对于研究植物耐盐机制是一个很好的选择，但是目前我国关于互花米草作为耐盐基因资源方面的研究并不多见。为了进一步了解互花米草抗盐性的分子机制，本研究以互花米草为材料，克隆得到了互花米草Na+/H+逆向转运蛋白基因[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]，利用生物信息学软件及网站对获得的基因核苷酸序列及编码的蛋白质序列进行分析，利用Qiagene Rotor Gene Q荧光实时定量PCR仪对互花米草在NaCl及ABA不同处理时间条件下表达量的变化情况进行检测，为的进一步开发利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

互花米草种子来源于山东莱州海滨，放置于4 ℃保存。取出保存的种子播种于耶土 ∶[KG-*3]黑土=1 ∶[KG-*3]1 的培养基质中，于25 ℃、光照16 h、黑暗8 h的温室条件下进行培养，2周后选取长势一致的植株移栽到小方盆中继续培养至4～5叶龄。用于基因克隆的取材：用 600 mmol/L NaCL溶液浇灌幼苗 48 h；用于定量表达分析的取材：分别用600 mmol/L NaCl溶液和 100 μmol/L ABA溶液对幼苗进行浇灌和喷洒，处理时间为0（对照）、3、6、12、24、48 h，每个处理重复3次。所有取材均经液氮速冻后于-80 ℃保存。

大肠杆菌DH5α为实验室保存；pMD18-T载体、Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、dNTP Mix、DNA限制性内切酶均购自TaKaRa公司；BIOZOL RNA Kit购于BIOFLUX公司；Reverse Transcriptase试剂盒购于Promega公司；Kanamycin Sulfate购于Sigma公司；试验中所用其他试剂大多为国产分析纯，部分试剂是参照文献[13]自行配制的，所有引物的合成均由北京华大六合基因公司合成。

1.2试验方法

反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s；40个循环），并分析试验结果。

1.3数据分析

数据采用Origin 8.0进行处理，利用SPSS 19.0进行统计分析，差异显著性水平α=0.05。

2结果与分析

2.1互花米草的克隆及序列分析

根据实验室互花米草转录组测序结果及Blast比对分析设计特异引物，分别进行5′RACE及3′RACE（图1），根据测序结果进行比对拼接获得[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]基因全长序列信息（图2）。

基因全长序列为2 277 bp，开放阅读框（ORF）为1 623 bp，编码540个氨基酸残基（图2）。ExPASy 在线程序预测其编码的蛋白质分子质量为 59.4 ku，等电点为8.89。经TMHMM在线程序分析得SaNHX1蛋白是一个典型的跨膜转运蛋白，预测其含有11个跨膜结构域（图3），这一结果与之前的报道[4，14]是一致的。将克隆到的基因序列在NCBI网站上进行Blast比对，结果发现，其与芦苇、玉米、水稻等的Na+/H+逆向转运蛋白NHX亲缘关系相近，相似性依次为94%、92%、91%。取高度相似（相似度>70%）的部分同源序列，使用Clustal X软件进行同源序列比对，结果发现NHX1 蛋白序列具有高度保守区，且在 SaNHX1 蛋白上含有NHX抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点 [15]及糖基化位点（图4）。从构建的NJ系统进化树（图5）上可以看到NHX主要分为两大类，一类是定位于液泡膜上的蛋白，如AtNHX1、AtNHX2等；另一类是定位于质膜上的蛋白，如AtNHX5、AtNHX6，其中SaNHX1蛋白归属于液泡膜蛋白。同时定位到液泡膜上的蛋白又分为单子叶与双子叶两类，这说明单子叶植物和双子叶植物的NHX在进化上存在差异[16]，其中SaNHX1蛋白与单子叶植物的NHX蛋白亲缘关系较近。[FL）]

3结论与讨论

随着土壤盐渍化的加重，Na+/H+逆向转运蛋白对于植物抵抗外界盐渍环境具有非常重要的意義。本试验从盐生植物互花米草中克隆得到了编码液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的基因，对其编码的蛋白质预测结果显示，SaNHX1具有典型的跨膜结构域，且跨膜区数目与之前的报道一致，同时该蛋白上还存在NHX抑制剂氨氯吡嗪脒结合位点及糖基化位点，这些都是NHX的重要特性。系统进化分析表明，SaNHX1属于液泡膜型NHX，而且与单子叶植物聚为一类，这表明单子叶植物与双子叶植物NHX在进化上可能存在着一为进一步探讨互花米草的耐盐机制，本研究利用荧光实时定量PCR仪对互花米草在NaCl 及ABA不同胁迫时间条件下，其[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]表达量进行分析。研究结果显示，无论是在盐胁迫下，还是在ABA胁迫下，[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]的表达量都发生了定的差异。

[CM（24]很大的变化，这说明在这2种胁迫下

目前，随着土壤盐渍化问题地日益加重，依靠分子生物学手段来克隆相关耐盐基因[17-18]，并将其转移到非抗盐的作物中，以培育出耐盐的转基因新品种显得尤为重要，这不仅可以在一定程度上开发利用盐碱土地，而且对于提高农作物的产量具有非常重要的意义。目前关于[WTBX][STBX]SaNHX1[WTBZ][STBZ]的过量表达试验正在进行中。

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