山羊PMEL基因生物信息学分析

李丽莎��+李祥龙��+毛艳朋

摘要：基于生物基因组学数据库，对山羊PMEL基因进行生物信息学分析，为研究该基因的功能提供依据。根据GenBank中山羊PMEL基因编码蛋白序列（GenBank登录号：XP_005680442.1），利用ExPASy数据库中的ProtParam、ProtScale程序分別预测理化性质、疏水性；利用CBS Prediction Servers数据库中的SignalP、TMHMM、Protfun程序分别预测信号肽、跨膜区及其功能；利用Predict Protein、PSORT Ⅱ Prediction、Motif Scan软件分别预测二级结构、亚细胞定位、功能位点，并对不同物种PMEL基因构建系统发育树。结果表明：山羊PMEL基因共编码685个氨基酸，属可溶性不稳定蛋白，无信号肽，在接近肽链的C-端存在1个跨膜区；二级结构以无规卷曲为主，该蛋白主要在内质网中发挥运输、结合、信号转导作用；不同物种PMEL基因的系统进化情况与生物进化过程中的动物学分类相符。山羊PMEL基因编码蛋白在生物进化中具有较强保守性，该基因结构和功能的分析为山羊PMEL基因遗传特性的进一步研究奠定了基础。

关键词：PMEL；山羊；生物信息

中图分类号： Q785；S826.9+2文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0047-04

前黑素小体蛋白（premelanosome protein，PMEL）别称gp100、ME20、PMEL17、silver[1]，由Sliver基因编码，只在皮肤黑色素细胞、眼色素层黑素细胞、视网膜色素上皮细胞中进行表达[2]。前黑素小体蛋白是一种黑色素瘤特异性糖蛋白，对黑素小体的发育具有重要作用，通过形成蛋白水解的纤维状矩阵从而使黑色素沉积[3]。人类PMEL基因编码蛋白是一种黑素细胞特异性糖蛋白[4-5]，该位点编码PMEL17蛋白，与小鼠的silver基因同源，编码的蛋白分子质量为70 ku，由668个氨基酸构成；此外，该基因还编码gp100蛋白，这2种蛋白质通过基因交替剪接成2个竞争性3′接受位点而产生，由于催化活性的不同，这2个位点可产生2种蛋白质[6]。在色素细胞中，黑素小体是一种专门用于合成、储存、转运黑素的细胞器，作为哺乳动物和其他脊椎动物的色素沉着来源[7]。PMEL作为黑素小体的一种结构蛋白，参与黑素小体由Ⅰ期到Ⅱ期的发育，这对后期黑素小体的形成及黑色素的沉积尤为重要。动物的被毛颜色是重要的质量性状和经济性状，PMEL基因是最优秀的稀释基因家族成员，该基因在鼠[8]、马[9]、牛[10]、猫[11]、鸡[12]等家养动物中的突变已被报道，这些突变均能使动物形成银色表型，并逐渐损伤动物的听觉和视觉功能。随着人们对自然风潮的崇尚，天然毛色羊绒和羊毛的选育、生产已有广泛的市场基础，但鲜有关于山羊PMEL基因结构和功能的相关研究。本研究在已有山羊PMEL基因编码蛋白序列的基础上，利用生物信息学方法对其理化性质、疏水性、信号肽、二级结构、亚细胞定位、功能位点及其功能进行预测，基于邻接法对不同物种PMEL基因进行系统发育分析，为后期研究山羊PMEL基因结构和功能对其突变的影响提供依据。

1材料与方法

1.2方法

1.2.1山羊PMEL基因开放阅读框的确定通过NCBI中的ORF finder确定山羊PMEL基因开放阅读框。

1.2.2山羊PMEL基因编码蛋白的生物信息学分析通过ExPASy数据库（http：//www.expasy.org/）提供的ProtParam在线程序预测该基因编码蛋白的氨基酸组成、等电点、正/负电荷残基数、原子总数、摩尔消光系数、半衰期、不稳定指数、脂肪族氨基酸指数、总平均亲水性等；通过ProtScale软件预测疏水性。通过CBS Prediction Servers数据库（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）提供的SignalP 4.1 Server在线程序判断该基因编码蛋白是否存在信号肽；通过TMHMM Server v.2.0软件预测跨膜结构区域；通过Protfun 2.2 Server软件预测该基因编码蛋白的功能分类。通过Predict Protein软件（https：//www.predictprotein.org/）预测蛋白质的二级结构。通过PSORT Ⅱ Prediction软件（http：//psort.hgc.jp/form2.html）预测该蛋白在细胞内的具体存在位置。通过Motif Scan软件（http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan）预测该基因的功能位点。

1.2.3不同物种PMEL基因的系统发育本研究通过Clustal W程序对16个物种PMEL基因编码蛋白序列进行多重序列比对，并利用MrBayes软件构建系统发育树。其中，设置原鸡为外群，核酸替代模型为GTR模型（Nst=6），每个位点的替换速率为Gamma（Rates=Gamma），并运行100 000代（Ngen=100 000），每100代保存1棵树（Samplefreq=100），舍弃老化样本（sump burnin=250）后再将剩余的样本构建一致树。

2结果与分析

2.1PMEL基因的开放阅读框

利用NCBI中的ORF finder对山羊PMEL基因的开放阅读框进行定位。起始密码子位于第14个核苷酸，终止密码子位于第2 071个核苷酸，共编码685个氨基酸。

2.2PMEL基因的理化性质

利用ProtParam软件分析山羊PMEL基因编码蛋白的理化性质。由该蛋白的氨基酸组成（图1）可知，山羊PMEL基因共编码685个氨基酸，其中亮氨酸（Leu）含量最高，占全部氨基酸的10.5%。带负电氨基酸（Asp+Glu）、带正电氨基酸（Arg+Lys）残基的数量分别为53、51个。分子式为C3232H5122N890O984S26，原子总数为10 254。所有半胱氨酸形成胱氨酸（cystines）时的消光系数为98 735 L/（mol·cm），对应的吸光度为1.352；所有半胱氨酸均不能形成胱氨酸时的消光系数为 97 860 L/（mol·cm），对应的吸光度为1.340。哺乳动物网织红细胞的半衰期为30 h，不稳定指数为46.77，脂肪族氨基酸指数为84.38，亲水性总平均值为-0.093。[FL）]

2.3PMEL基因的疏水性

利用ProtScale软件分析山羊PMEL基因编码蛋白的疏/亲水性（图2）。其中，第624位异亮氨酸（I）得分最高，为3389，表示该位点的疏水性最强；第66位精氨酸（R）得分最低，为-2.567，表示该位点的亲水性最强。整条多肽链呈现为亲水性，预测山羊PMEL基因编码蛋白为可溶性蛋白。

2.4PMEL基因的信号肽

利用SignalP 4.1 Server软件分析山羊PMEL基因编码蛋白的信号肽（图3）。结果显示，C值（raw cleavage site score，原始剪切位点得分）、S值（signal peptide score，信号肽分数）、Y值（combined cleavage site score，被结合的剪切位点的分数）不符合1个典型信号肽（C、Y值趋向于+1；S值在切割位点之前高，而在切割位点之后降低）的标准，表明山羊PMEL基因不存在信号肽。

2.5PMEL基因的跨膜区

利用TMHMM Server v.2.0软件分析山羊PMEL基因编码蛋白的跨膜区（图4）。结果显示，存在1个跨膜区，即 618～637，表明山羊PMEL基因编码蛋白为1个跨膜蛋白。

2.6PMEL基因蛋白的功能

通过Protfun 2.2 Server软件预测山羊PMEL基因编码蛋白的功能。结果显示，该蛋白发挥运输和结合、嘌呤和嘧啶、生物合成的辅酶因子、中央中间代谢功能的概率最高，分别为0736、0.542、0.135、0.113；在基因本体分类中发挥信号转导、免疫应答作用的概率最高，分别为0.141、0.111。

2.7PMEL基因的二级结构

[JP3]通过Predict Protein软件预测山羊PMEL基因编码蛋白的二级结构。结果显示，H（alpha-helix，α螺旋） ∶[KG-*3]E（beta-sheet，β折叠） ∶[KG-*3]L（random coil，无规卷曲）=5.55% ∶[KG-*3]1927% ∶[KG-*3]7518%，

无规卷曲在整个二级结构中的比例较大，使蛋白质构象呈现出多样性的特性。

2.8PMEL基因的亞细胞定位

通过PSORT Ⅱ Prediction软件预测山羊PMEL基因编码蛋白的亚细胞定位。结果显示，该蛋白存在于内质网、线粒体、细胞质膜的概率最高，分别为34.8%、26.1%、17.4%。

2.9PMEL基因的功能位点

通过Motif Scan软件预测山羊PMEL基因编码蛋白的功能位点。结果（图5）显示，多囊肾病区域（polycystic kidney disease domain，PKD）位于第290～330个氨基酸，苏氨酸密集区域（threonine-rich region，THR-RICH）位于第347～451个氨基酸。[FL）]

2.10PMEL基因的系统发育分析

通过贝叶斯算法构建的系统发育树（图6）显示，山羊与绵羊、家牛、野牛的亲缘关系最近，与偶蹄目中单峰驼、羊驼的亲缘关系也较近。食肉目中家猫与大熊猫的亲缘关系最近，灵长目中黑猩猩、东非狒狒、人类、苏门答腊猩猩的亲缘关系最近，啮齿目中小家鼠与褐家鼠的亲缘关系最近。裸鼢鼠虽为啮齿动物，但与小家鼠和褐家鼠的亲缘关系较远，与其他哺乳动物的亲缘关系也较远。哺乳纲与鸟纲（原鸡）之间的亲缘关系最远。上述不同物种间的亲缘关系与生物进化过程中动物学分类相符合。[FL）]

3讨论

前黑素小体蛋白作为一种黑素细胞特异性糖蛋白，直接参与黑素小体的生物合成，并在黑色素瘤和正常的黑色素细胞中高度表达[5]。免疫组化（immunocytochemistry）研究结果表明，在不同的毛发生长阶段，黑素细胞表达的蛋白也有差异。当毛发进入生长期，毛球部的黑色细胞具有明显的树突状结构，前黑素小体蛋白、酪氨酸酶、酪氨酸酶相关蛋白1均能表达，但在毛囊外根鞘的黑素细胞中只有前黑素小体蛋白可以表达[14]。对于前黑素小体蛋白的研究可为黑色素的集聚、黑素细胞的成熟分化提供重要依据。前黑素小体蛋白的突变主要发生在家养动物中，如Martnez等发现小鼠silv使其体内黑色素细胞丢失，导致毛色变为银灰色[8]。Brunberg等发现，该蛋白的多态性与马银色毛色的形成具有极大相关性[9]。Menotti等发现，家猫SILVER位点的突变对黑色素的产物也有影响[11]。Schmutz等发现，PMEL的1个缺失和PMEL与MCIR之间的互作对能影响高原牛的毛色[15]。

利用生物信息学的方法对山羊PMEL基因编码蛋白的氨基酸组成、疏/亲水性、信号肽、跨膜区等一级结构、二级结构、功能位点、亚细胞定位进行预测。为使预测和分析结果具有可靠性，采用多种不同软件，且预测分析软件所用的原理和算法各不相同，预测和分析结果具有较高的可信度[16]。推算出山羊PMEL蛋白由685个氨基酸组成，其中亮氨酸含量最高，整条多肽链呈现为亲水性，无信号肽。该基因编码蛋白是一种跨膜蛋白，存在1个跨膜区，并包含1个PKD区和苏氨酸富集区，这与Adema等、Maresh等对前黑素小体蛋白的研究结果[17-18]一致。已有研究表明，前黑素小体蛋白17包含1个RPT重复区域（proline/serine/threonine-rich repeat domain），该区域可决定体内黑素小体丝状假足的形成，并影响黑色素的合成效率[13]。本研究预测出的山羊PMEL基因编码蛋白的1个苏氨酸富集区，可能对山羊绒（毛）的黑色素合成具有重要影响。山羊前黑素小体蛋白主要在内质网中发挥运输、结合、信号转导作用。该蛋白的二级结构组成中，无规卷曲所占比例较大，使蛋白质的构象呈现出多样性的特性。利用贝叶斯算法对PMEL基因进行系统发育分析，发现山羊PMEL基因与绵羊、家牛、野牛的亲缘关系最近，哺乳纲与鸟纲之间的亲缘关系最远，这不仅符合动物学分类，并反映了不同物种PMEL编码蛋白结构上的稳定性对其生物学功能的重要意义。

4结论

山羊PMEL蛋白由685个氨基酸组成，是一种不稳定的可溶性蛋白，无信号肽，在接近肽链的C-端存在1个跨膜区。该蛋白主要在内质网中发挥运输、结合、信号转导作用。在二级结构中，无规卷曲所占比例较大，使蛋白质的构象呈现出多样性的特性。系统发育分析表明，PMEL基因在生物进化过程中符合动物学分类，具有较高的保守性。

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