牦牛PRDX5基因的克隆测序及其在牦牛与犏牛睾丸中的表达差异

唐会会+郑玉才+王鹏非+金素钰+黄林

摘要：测定牦牛基因序列，并比较其在牦牛和雄性不育犏牛睾丸组织中的表达差异，以探究该基因与犏牛雄性不育的关系。从牦牛睾丸组织中提取总RNA，采用RT-PCR技术克隆并测序获得牦牛基因的cDNA序列；利用实时荧光定量RT-PCR技术检测该基因在牦牛与犏牛睾丸组织中的表达情况。结果表明：克隆获得的牦牛Prdx5序列长759 bp，包含长660 bp的CDS区，该序列与普通牛基因相差4个碱基，序列同源性为99.47%，相差的4个核苷酸导致推导的氨基酸序列存在3个氨基酸残基差异；[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在牦牛和犏牛睾丸组织中均有表达，在牦牛睾丸组织中的表达量极显著高于犏牛（P<0.01），是犏牛睾丸组织中表达量的6倍，提示Prdx5在犏牛睾丸组织中低水平表达可能与其雄性不育有关。

关键词：牦牛；杂交雄性不育；[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因；基因表达；睾丸

中图分类号： Q785；S823.8文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0053-04

过氧化物氧化还原酶（Peroxiredoxin，PRDX）家族是过氧化物酶超家族成员[1]，广泛分布于原核及真核生物体内[2-3]。该家族蛋白利用其N-端保守的Cys残基催化还原细胞内活性氧（ROS），从而保护细胞免受内外界环境中氧化胁迫带来的损害，是一类巯基依赖性抗氧化蛋白酶[3]。PRDX5别称AOEB166、PMP20、AOPP，是哺乳动物Prx家族中唯一的非典型2-Cys Prx [4]，主要分布于细胞的线粒体、溶酶体、细胞质、细胞核中[5-8]。该酶不仅在免疫调控[9]、细胞凋亡[10]、信号通路调节[11]等方面发挥作用，其功能主要在于还原细胞内过量的ROS。过量的ROS会引起细胞及组织损伤，对动物精子细胞更易造成损害，使精子细胞膜脂质过氧化、DNA结构破坏、凋亡加速，最终导致哺乳动物雄性不育[12]。据估计，约1/4不育男性患者精液中ROS水平升高[13-14]。PRDX5能以高效的还原能力[15]保护精子免受氧化胁迫损害，因此Prdx5水平偏低可能与哺乳动物雄性不育有关。

牦牛（Bos grunniens）是青藏高原特有牛种，其与普通牛（Bos taurus）的杂交后代（犏牛）表现出F1至F3代雄性不育，这极大限制了犏牛杂种优势的固定，是牦牛杂交改良的一大难题。目前，有关犏牛雄性不育分子机制研究的相关基因如b-Boule[16]、[WTBX][STBX]Dmrt7[WTBZ][STBZ][17]、[WTBX][STBX]Sycp3[WTBZ][STBZ][18]、[WTBX][STBX]Fabp5、Fabp9[WTBZ][STBZ][19]、[WTBX][STBX]Piwil1[WTBZ][STBZ][20]、Bvh[21]、Ldhc[22]等，主要涉及精子减数分裂阻滞、能量代谢、DNA甲基化、转录调控等方面，但从睾丸过氧胁迫角度探究犏牛雄性不育的机制尚未见报道。对牦牛与犏牛睾丸组织蛋白质组学研究结果进行比较发现，牦牛睾丸PRDX5蛋白水平远高于犏牛（约3.9倍），过低的PRDX5蛋白水平可能会使犏牛睾丸組织遭受ROS氧化胁迫，影响精子的正常发生。本研究通过基因克隆的方法获得了牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的完整编码区序列，并比较了牦牛与普通牛的基因序列及氨基酸序列；同时利用实时荧光定量PCR方法分析该基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的mRNA水平，以探索[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因表达水平与犏牛雄性不育的关联。

1材料与方法

1.1材料

供试成年牦牛（n=9）及犏牛（n=7）的睾丸组织均于秋季采自四川省成都市青白江区屠宰场，采集后立即放入液氮速冻并送回实验室。所有样品均于-80 ℃保存备用。

1.2方法

1.2.1[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的克隆测序

利用TRIzol试剂（Invitrogen公司）按照其产品操作说明从睾丸组织中提取总RNA。以牦牛总RNA为模板，以Oligo（dT）18为反转录引物，采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo公司）进行反转录合成cDNA第1链。根据已公布普通牛的[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]核酸序列（GenBank登录号：NM_174749），运用Primer Premier 5.0软件在该序列的CDS区两侧设计PCR特异引物，即F：5′-TCCGCCCAGCCTTCTACCTC-3′；R：5′-GAAAGGGCCGGAGGAGGATAT-3′。以cDNA为模板，按照如下程序进行扩增：95 ℃预变性4 min；95 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。预期能扩增出包含[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因CDS区在内的759 bp的片段。PCR产物采用2.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。RT-PCR产物经E.Z.N.A.TM Cycle-Pure Kit（OMEGA公司）纯化后连接到pMD19-T载体（TaKaRa公司），再转化至大肠杆菌DH5α宿主中进行克隆。抗氨苄重组筛选后挑选出20个阳性单克隆进行扩大培养，经菌液PCR鉴定后，将含有目的片段的单克隆双向测序，测序引物为pUC系列载体通用引物M13F及M13R。

1.2.2牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的序列特征分析在NCBI数据库中使用Blast工具将所测序列与野牦牛、普通牛的cDNA序列进行同源性比对，并在该数据库中比对其编码的氨基酸序列。使用蛋白质预测在线分析软件Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html）对Prdx5编码的氨基酸序列的二级结构进行预测。

1.2.3牦牛及犏牛睾丸中基因丰度检测采用实时荧光定量PCR方法对牦牛及犏牛睾丸组织中的[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因mRNA表达水平进行检测。根据克隆测序后的cDNA序列以及普通牛内参基因Gapdh、18S rRNA序列信息，采用Primer Premier 5.0软件分别设计定量PCR特异引物（表1）。提取的总RNA经质量检测合格后，取4 μg利用上述试剂盒自带的随机六聚体引物进行反转录，合成cDNA作[HJ1.4mm]為定量模板。PCR反应体系为：QuantiFastTM SYBR Green PCR Master mix（QIAGEN公司）12.5 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O 9.5 μL，总体积共25 μL。PCR程序为：[HJ]预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 15 s，引物退火（退火温度详见表1）20 s，72 ℃ 延伸15 s，共40个循环。定量PCR检测分为牦牛组和犏牛组，组内每个样品[JP3]同时检测目的基因和2个内参基因，每个基因设3个平行重复。

1.2.4数据统计分析每个样品的检测结果利用2个内参基因CT值的几何平均数对目的基因进行校正。牦牛和犏牛组间相对表达水平使用2-ΔΔCT法[23]进行计算；采用SPSS 13.0软件对2组数据进行独立样本t检验分析，以α=0.05作为差异显著标准。[FL）]

2结果与分析

2.1牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的克隆测序

采用RT-PCR方法对牦牛睾丸组织中的基因进行扩增，扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，获得1条特异的与预期大小相一致的DNA片段（图1）。该片段经克隆测序显示其长度为759 bp，包含长660 bp的完整CDS区，与普通牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]序列比对证实该片段为牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因序列。相差4个碱基，其CDS区的227、231、433、476位碱基依次为A、A、G、A，普通牛则为G、G、A、G。4个碱基差异导致牦牛与普通牛氨基酸序列存在3处差异，即牦牛的76、145、159位氨基酸依次为Glu、Ala、Asn，普通牛则为Gly、Thr、Ser，氨基酸序列相似性为98.63%。

牦牛[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因推导的氨基酸序列含219个氨基酸残基，是一个肽前体，其N-末端Met1至Met58区段为定位于线粒体的导肽，除导肽以外的肽段部分为成熟肽；成熟肽的C-末端还存在靶向进入过氧化物酶体的SQL信号序列[24]。Prdx5成熟肽段区共有3个Cys残基，其中Cys47为该酶保守的催化残基，Cys151为还原活性必需的非典型Cys残基，2个活性Cys残基周围高度保守的特征序列分别为“PGAFTPGCSKTHLPGF”、“LNVEPDGTGLTCSLA”[24]（图2）。件]序列及内参基因信息设计特异定量引物，定量PCR扩增获得的溶解曲线峰形单一，表明特异性好。所建立的所有基因标准曲线显示，扩增效率均落在 95%～105%范围内，符合相应算法要求。定量结果分析表明，[WTBX]]基因在牦牛和犏牛睾丸组织中均有表达，在牦牛睾丸组织中的表达量极显著高于犏牛（P<0.01），是犏牛睾丸组织中表达量的6倍（图3）。

3结论与讨论

本研究成功克隆并获得了牦牛睾丸组织基因的cDNA序列。牦牛[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]所编码的氨基酸序列与普通牛相似性为98.63%，相差3个氨基酸残基，但均不位于该酶的活性保守区内，表明该基因在进化上具有较高的保守性[2]。有差异的3个氨基酸残基均位于成熟肽段内；从差异氨基酸极性上看，3个氨基酸中有2个在牦牛和普通牛中不变，仅145位氨基酸残基在普通牛中为极性的Thr，而牦牛中为非极性的Ala。这种极性的差异是否导致空间结构的变化，最终影响该酶在牦牛中的功能尚需进一步研究。

哺乳动物精细胞中的ROS对于受精、染色质浓缩、细胞膜的重构、细胞内信号通路的激活、精子获能、顶体反应是必不可少的[25]。哺乳动物精细胞膜由大量不饱和脂肪酸组成，且细胞质仅存有低浓度可抵抗ROS的酶，因此氧化胁迫极易导致脂质过氧化而首先破坏精子细胞膜。此外，过量的ROS会影响精子运动，损坏DNA结构，加速精细胞凋亡，引起精子数目减少、活力降低、功能损伤，最终导致雄性不育或胚胎发育异常[12]。Leyens等研究了[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在普通牛的脑、心、肾、睾丸等22个组织中的表达情况，结果表明[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在睾丸组织中的表达量最高，且远远高于其他组织[24]，提示[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的高表达可能与牛的繁育功能密切相关。本研究实时荧光定量PCR结果分析显示，[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]在牦牛睾丸组织中的表达量是犏牛的6倍，这与笔者所在课题组前期蛋白质组学分析得到的结果相一致，即PRDX5蛋白在牦牛睾丸组织中的含量是犏牛的6倍。Knoops等通过比较PRDX5催化过氧化氢与有机过氧化物的速率，认为PRDX5能更高速特异地还原脂质过氧化物[4]，提示[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的表达水平可能对精子细胞膜完整性及精子的存亡具有重要意义。PRDX5定位于精子的头部和线粒体膜间隙，其表达水平对精子DNA的完整性及精子运动能力均产生影响[26]。此外，细胞中过量的过氧氮族（reactive nitrogen species，RNS）可使睾丸功能紊乱、促性腺激素分泌降低，从而对哺乳动物的生殖能力造成损害[27]。PRDX5作为一种过氧亚硝基还原酶，能高速催化还原过氧亚硝基[15，28]，保护睾丸组织内细胞免遭过氮胁迫。相对于牦牛而言，犏牛睾丸组织中[WTBX][STBX]Prdx5[WTBZ][STBZ]基因的低表达水平可能导致精子损伤凋亡[18]，从而使睾丸组织功能紊乱、激素水平改变以致雄性不育，[WTBX][STBX]PRDX5[WTBZ][STBZ]基因的表达水平可能与犏牛雄性不育有关。

参考文献：

[1]Rhee S G，Kang S W，Chang T S，et al. Peroxiredoxin，a novel family of peroxidases[J]. IUBMB Life，2001，52（1/2）：35-41.

[2]Knoops B，Loumaye E，van der Eecken V. Evolution of the peroxiredoxins[J]. Subcellular Biochemistry，2007，44：27-40.

[3]Chae H Z，Robison K，Poole L B，et al. Cloning and sequencing of thiol-specific antioxidant from mammalian brain：alkyl hydroperoxide reductase and thiol-specific antioxidant define a large family of antioxidant enzymes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1994，91（15）：7017-7021.

[4]Knoops B，Goemaere J，van der Eecken V，et al. Peroxiredoxin 5：structure，mechanism，and function of the mammalian atypical 2-Cys peroxiredoxin[J]. Antioxidants & Redox Signaling，2011，15（3）：817-829.

[5]Seo M S，Kang S W，Kim K，et al. Identification of a new type of mammalian peroxiredoxin that forms an intramolecular disulfide as a reaction intermediate[J]. The Journal of Biological Chemistry，2000，275（27）：20346-20354.

[6]Declercq J P，Evrard C，Clippe A，et al. Crystal structure of human peroxiredoxin 5，a novel type of mammalian peroxiredoxin at 1.5 A resolution[J]. Journal of Molecular Biology，2001，311（4）：751-759.

[7]Knoops B，Clippe A，Bogard C，et al. Cloning and characterization of AOEB166，a novel mammalian antioxidant enzyme of the peroxiredoxin family[J]. The Journal of Biological Chemistry，1999，274（43）：30451-30458.

[8]Yamashita H，Avraham S，Jiang S，et al. Characterization of human and murine PMP20 peroxisomal proteins that exhibit antioxidant activity in vitro[J]. The Journal of Biological Chemistry，1999，274（42）：29897-29904.

[9]Sensi M，Pietra G，Molla A，et al. Peptides with dual binding specificity for HLA-A2 and HLA-E are encoded by alternatively spliced isoforms of the antioxidant enzyme peroxiredoxin 5[J]. International Immunology，2009，21（3）：257-268.[ZK）]

[10]Kropotov A，Gogvadze V，Shupliakov O，et al. Peroxiredoxin V is essential for protection against apoptosis in human lung carcinoma cells[J]. Experimental Cell Research，2006，312（15）：2806-2815.

[11]Choi H I，Chung K J，Yang H Y，et al. Peroxiredoxin V selectively regulates IL-6 production by modulating the Jak2-Stat5 pathway[J]. Free Radical Biology & Medicine，2013，65：270-279.

[12]Walczak J R，Wolski J K，Slowikowska H J. The role of oxidative stress and antioxidants in male fertility[J]. Central European Journal of Urology，2013，66（1）：60-67.

[13]Aitken R J，de Iuliis G N，Finnie J M，et al. Analysis of the relationships between oxidative stress，DNA damage and sperm vitality in a patient population：development of diagnostic criteria[J]. Human Reproduction （Oxford，England），2010，25（10）：2415-2426.

[14]Agarwal A，Nallella K P，Allamaneni S S，et al. Role of antioxidants in treatment of male infertility：an overview of the literature[J]. Reproductive BioMedicine Online，2004，8（6）：616-627.

[15]Trujillo M，Clippe A，Manta B，et al. Pre-steady state kinetic characterization of human peroxiredoxin 5：taking advantage of Trp84 fluorescence increase upon oxidation[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics，2007，467（1）：95-106.

[16]Li B，Ngo S，Wu W，et al. Identification and characterization of yak （Bos grunniens） b-Boule gene and its alternative splice variants[J]. Gene，2014，550（2）：193-199.

[17]金帥，郭宪，包鹏甲，等. 牦牛和犏牛[WTBX][STBX]Dmrt7[WTBZ][STBZ]基因序列分析及其在睾丸组织中的表达水平[J]. 中国农业科学，2013，46（5）：1036-1043.

[18]屈旭光，李齐发，刘振山，等. 牦牛、犏牛睾丸组织中[WTBX][STBX]SYCP3[WTBZ][STBZ]基因mRNA表达水平研究[J]. 畜牧兽医学报，2008，39（8）：1132-1136.

[19]付伟，黄林，刘文静，等. 牦牛和雄性不育犏牛睾丸[WTBX][STBX]FABP5和FABP9[WTBZ][STBZ]基因mRNA水平及能量代谢相关酶活力的比较[J]. 畜牧兽医学报，2015，46（4）：561-567.

[20]Gu Y，Li Q，Pan Z，et al. Molecular cloning，gene expression and methylation status analysis of PIWIL1 in cattle-yaks and the parental generation[J]. Animal Reproduction Science，2013，140（3/4）：131-137.

[21]Luo H，Zhou Y，Li Y，et al. Splice variants and promoter methylation status of the Bovine Vasa Homology （Bvh） gene may be involved in bull spermatogenesis[J]. BMC Genetics，2013，14：58.

[22]Huang L，Jin S，Xu Y，et al. Quantitation of alternative splicing variants of lactate dehydrogenase C gene in testes of adult yak，sexually immature yak calf and sterile male hybrid of yak[J]. Canadian Journal of Animal Science，2012，92（3）：291-296.[HJ1.74mm]

[23]Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J]. Methods，2001，25（4）：402-408.

[24]Leyens G，Donnay I，Knoops B. Cloning of bovine peroxiredoxins-gene expression in bovine tissues and amino acid sequence comparison with rat，mouse and Primate peroxiredoxins[J]. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B，Biochemistry & Molecular Biology，2003，136（4）：943-955.

[25]Pons R H，Sion B，Saez F，et al. Role of reactive oxygen species （ROS） on human spermatozoa and male infertility[J]. Gynécologie Obstétrique & Fertilité，2009，37（6）：529-535.

[26]Oflaherty C，de Souza A R. Hydrogen peroxide modifies human sperm peroxiredoxins in a dose-dependent manner[J]. Biology of Reproduction，2011，84（2）：238-247.

[27]Doshi S B，Khullar K，Sharma R K，et al. Role of reactive nitrogen species in male infertility[J]. Reproductive Biology and Endocrinology，2012，10：109.

[28]Dubuisson M，van der Stricht D，Clippe A，et al. Human peroxiredoxin 5 is a peroxynitrite reductase[J]. FEBS Letters，2004，571（1/2/3）：161-165.