禾谷类作物高效启动子分析专用载体p14781pro—GUS的构建

蒲鹏+谢晓东+白子彧+郭雨+古同华+李明+王俊斌+孙守钧+丁博

摘要：启动子决定了基因的组织器官表达特异性及其在环境、内源激素作用下的诱导型表达，因此对启动子的分析有利于解析基因的表达模式及功能。对玉米Ubiquitin启动子控制的nptII抗性基因添加适宜的酶切位点，连接到pGWB433双元载体中，构建目标表达载体p14781pro-GUS。该载体具有适于在禾谷类作物中筛选转基因植株的Ubiquitin-nptII组件、启动子高效克隆的Gateway组件，且整合进载体的启动子可控制报告基因GUS的表达，以确定启动子的转录调控模式，因而能够更加深入便捷地研究禾谷类作物重要性状相关基因的启动子，推动针对重要性状的分子遗传改良。

关键词：启动子；载体构建；p14781pro-GUS；GUS蛋白；限制性内切酶

中图分类号： Q782文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0060-03

目前，应用于双子叶转基因体系中启动子分析的载体非常丰富，如pGWB系列载体，研究也已非常完备。而单子叶植物转基因体系的研究尽管已取得很好进展，但适于单子叶特别是禾谷类作物启动子研究的载体却非常有限。

在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV 35S启动子，禾谷类转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子[1]和来自水稻的Actin I启动子[2]。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因可在转基因植物的所有部位和所有发育阶段表达[3]。

Ubiquitin 启动子是一个在禾谷类作物中有较强表达的启动子，Ubiquitin启动子来自玉米多聚泛素蛋白基因（maize polyubi gene），它实际上包括Ubiquitin基因的启动子区、5′非翻译区和第一内含子。研究表明，Ubiquitin启动子在禾谷类作物中能组成型过量表达，表达效率高于35 S启动子[4]。

GUS的基因gusA（又称uidA）来自大肠杆菌菌株K12。Novel等研究并克隆了含有uidA基因的DNA片段，对其调控部分进行了分析[5-7]。Jefferson等进行了uidA基因的序列分析，该基因编码区长1 809 bp，并由此发展了uidA基因作为一个基因融合标记，使其得到了更广泛的应用[8]。该酶与5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸环己胺盐（X-Gluc）底物发生蓝色沉淀反应，检测容易、高效、方法多样，且灵敏度高于GFP检测[9]。GUS基因作为基因融合的标记，最初应用于大肠杆菌。后来发现几乎所有的高等植物，特别是已研究的烟草、矮牵牛及拟南芥等，都很少或几乎没有GUS活性[10]，因此GUS基因被广泛用作转基因植物中的报告基因。

相对于传统的使用限制性内切酶构建表达载体，由 Invitrogen 公司开发的Gateway克隆技术得到广大研究者的认同和青睐。该技术基于K噬菌体位点特异性重组原理[11]，其优点在于可以在不同的克隆载体之间实现DNA 片段的转移，并保持基因定位和阅读框架不发生改变。对于研究者来说，这项技術是进行载体构建的入门技术，简便易行。

本研究拟通过构建表达载体p14781pro-GUS，建立适用于禾谷类作物高效启动子功能分析的载体系统和评价体系。应用本载体，可通过Gateway克隆技术高效克隆目标启动子序列，由于Ubiquitin启动子和nptII抗性基因的结合，易于对禾谷类作物转基因株系进行筛选鉴定。此外，利用GUS报告基因的表达水平来衡量启动子的功能，也方便了启动子功能的鉴定。对禾谷类作物重要性状相关基因进行启动子研究，对推动针对重要性状的分子遗传改良有重要的理论和应用意义。

1材料与方法

1.1试验材料

质粒pGWB433、pEASY-ubi-npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]均为笔者实验室保存，ubi代表Ubiquitin启动子序列，npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]代表新霉素磷酸转移酶基因（Neomycin Phosphotransferase Ⅱ，NPTⅡ）。

大肠杆菌菌株（E.coli）DH5α、DB3.1感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2试剂和生物学软件

Phusion超保真DNA聚合酶和限制性内切酶购自New England Biolabs公司，pGEM-T Easy 载体购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，质粒提取试剂盒和特异性引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司，生物信息学研究所用软件为Geneious 8、Vector NTI Advanced 11。

进行TA克隆反应，将回收产物连接到载体pGEM-T easy上，热激转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取阳性克隆，摇菌培养，用质粒提取试剂盒收集质粒pGUN。

1.3.2ubi-npt[QX（Y15]Ⅱ[QX）]片段与pGWB433载体的组装将pGWB433和pGUN进行双酶切反应。酶切先用SacⅡ在37 ℃反应30 min，再加入1 μL AscI 37 ℃反应40 min，电泳检测。用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，产物通过T4 DNA连接酶连接，连接体系于25 ℃反应1 h后，转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞。菌落PCR验证转化反应产物，挑取验证正确的克隆进行测序（北京六合华大基因科技股份有限公司），具体的载体构建思路见图1。

2结果与分析

2.1pGUN载体的构建

为了进行双酶切反应，首先设计合成了包含AscⅠ、SacⅡ位点的1对引物，得到了pGUN载体。

2.2p14781pro-GUS载体构建

AscI对质粒pGWB433和pGUN进行单酶切，SacII对酶切之后的片段再次酶切，结果见图2。取SacII/AscI酶切回收后的片段，按照大约1 ∶[KG-*3]1的分子比在T4 DNA连接酶催化下进行定向重组，菌落PCR结果见图3。把菌落PCR筛选出的质粒进行测序，做进一步验证，测序结果正确（测序图未显示），p14781pro-GUS载体见图4。

3讨论

启动子决定了基因的表达模式，包括在组织器官的表达特异性和在诱导物作用下的诱导型表达，因此对启动子功能分析有利于解析基因的生物学功能。外源基因在受体植物内持续、高效地表达不但造成能量浪费，往往还会引起植物的形态和生长发育的改变。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对诱导型及特异表达型启动子的研究和应用越来越重视，而作物与粮食安全和人类生活质量密切相关，对禾谷类作物启动子的研究与特异性启动子的筛选越来越重要。

本研究选用Ubiquitin启动子调控抗性基因的表达，与已有的表达载体多采用CaMV 35S启动子相比，抗性基因的表达水平可明显提高[4]，对于遗传转化效率普遍较低的禾谷类作物，能更有效地筛选出阳性植株，辅助PCR进行筛选阳性植株会提高筛选效率[12]。

该载体对启动子分析的元件为gusA基因，与此前笔者实验室构建的pUKGF载体同为研究禾谷类作物启动子功能的表达载体[13]。在应用中将2个载体进行比较可知：pUKGF可对活体植物进行连续活体观察，观测手段简单，但对具有自发荧光的组织就无法准确进行此类分析。Jordan观测到在1株转基因小麦的不同胚中GFP强度有明显差异[14]；p14781pro-GUS则需要经过X-Gluc组织化学染色，步骤较荧光观测繁琐，且为破坏性试验，植物不可继续生长发育，但对GUS酶的放大作用与植物自身无GUS活性，检测效果灵敏，肉眼即可观测结果，因此应用范围更广泛[9]。在观测根系等组织特异表达的启动子效率时可采用p14781pro-GUS载体。笔者所在研究组已经成功采取GUS染色评价表达载体pKIGW在拟南芥中的应用效果[15]。

近年来，农杆菌介导转化禾谷类作物的成功，为进行基因功能分析奠定了基础[16-17]。本研究中构建的pUKGS载体可以利用Gateway技术克隆目的片段，分析启动子功能的载体的核心元件为attR1-Cmr-ccdB-attR2-tag-terminator，该表达载体即可用于下游植物遗传工程中的“后基因组研究”[18]，大大提高了克隆效率，可作为禾谷类作物遗传转化中的首选。

该载体系统所选择的质粒重组技术、报告基因、抗性标记基因，均是目前国际、国内植物转基因领域应用最多的元件，尤其是由Ubiquitin启动子调控抗性标记基因，能在禾谷类作物的阳性植株筛选上发挥独特作用。

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