红毛菜28SrDNA和IGS序列分析及系统发育

徐佳杰+姜波+朱建一+何渊+沈宗根

摘要：为了探讨中国境内红毛菜的物种关系及亲缘关系，对红毛菜核糖体基因的28S rDNA、IGS序列进行了研究。28S rDNA序列分析结果显示：江苏（LYG、NT）、福建（NRD1、NRD2）、广东（NA1、NA2、NA3）的7个海水红毛菜遗传距离为0～0.004；而威海（WH）的海水红毛菜与其他海水红毛菜的遗传距离为0.144～0.147；山西娘子关（NZG）、甘肃兴隆山（XLS）的2个淡水红毛菜之间的关系极近，遗传距离为0.001；淡水红毛菜与威海的海水红毛菜的遗传距离（0.125）小于淡水红毛菜与其他7个海水红毛菜的遗传距离（0.210～0.213）。对江苏、福建、广东的7个海水红毛菜的IGS序列进行分析显示，7个海水红毛菜亲缘关系极近。基于28S rDNA序列的系统进化树显示，中国境内采集到的红毛菜分为3个进化分支：2个淡水红毛菜形成独立1支，而海水红毛菜则分为2个进化分支，其中威海的海水红毛菜单独为1个分支，其他7个海水红毛菜归为另1个分支。由此推测，目前为止中国境内至少存在3种红毛菜。

关键词：红毛菜；28S rDNA；IGS；分类学

中图分类号： Q968.43+9；S188+.1

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0066-04

红毛菜（Bangia）属红藻门（Rhodophyta）红藻纲（Rhodophyceae）红毛菜亚纲（Bangiaophycidae）红毛菜目（Bangiales）红毛菜科（Bangiaceae）[1]。红毛菜的形态极其简单，为直立不分枝的丝状红藻[2]。红毛菜在全球的分布极为广泛，从北半球的北欧到南半球的新西兰都有分布[3]，包括海水环境、淡水环境[4]。红毛菜的传统分类方法是根据其形态（藻体长度、直径和颜色）、染色体数目、繁殖方式、生活环境和地理分布等特征进行研究[5-6]。由于红毛菜形态结构极其相似，且易受栖息环境的影响而发生变化[5]，因此仅依据传统分类学方法已经不能满足红毛菜的分类需求，不少研究者开始从分子水平对红毛菜进行分类研究[7-8]。

红毛菜核糖体RNA基因序列由18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA构成1个转录单元，彼此之间被转录内间隔区（ITS1、ITS2）隔开；转录单元之间则被基因内间隔区（IGS）隔开[9-10]。核糖体RNA基因序列不同区域由于功能需要不同，承受不同的选择压力而表现出不同的进化速率，如编码区序列（18S rDNA、5.8S rDNA、28S rDNA）具有功能需要，承受较高的选择压力而表现出较慢的进化速率，适用于种属间及以上水平的分类研究[11-12]；非编码区序列（ITS1、ITS2、IGS）则没有功能需要，承受较低的选择压力而表现出较快的进化速率，适用于种属间甚至种下水平的分类研究[13-15]。Freshwater等根据28S rDNA对红藻的13个物种进行序列分析，结果发现13个物种可以分为11目[11]，由此推测28S rDNA可能更适合用于红藻较高阶元间的系统发育研究。Pecchia等对向日葵茎溃疡病菌（Diaporthe helianthi）的18S rDNA 5′端的部分IGS序列进行分析，结果显示：来自阿根廷、法国、意大利、南斯拉夫、罗马尼亚的病菌可以分为3个独立的菌群[16]。

本研究首次对采自中国沿海地区、内陆地区10个不同采集地的红毛菜进行28S rDNA的分子系统学研究，分析中国境内红毛菜的物种关系。同时对江苏省、福建省、广东省的7个海水红毛菜的IGS序列进行分析，以探讨不同地区海水红毛菜间的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

10个红毛菜采集地分别是山东威海（WH）、江苏连云港（LYG）、江苏南通（NT）、福建莆田南日岛（2个采集地：NRD1、NRD2）、广东汕头南澳（3个采集地：NA1、NA2、NA3）的8个海水红毛菜，以及山西阳泉娘子关（NZG）、甘肃兰州兴隆山（XLS）的2个淡水红毛菜，具体信息见表1。将采集到的材料分别用海水、淡水初步清洗后阴干，置于-20 ℃保存备用。

1.2 DNA的提取

采用CTAB法对采自不同地理群的红毛菜进行DNA提取[17]，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整性，置于-20 ℃保存备用。

1.3 PCR扩增

引物序列如表2所示，PCR引物由苏州金维智生物科技有限公司合成。PCR反应体系为50 μL，包括：5 μL 10×LA Taq PCR Buffer Ⅱ（Mg2+Plus），5 μL dNTP Mixture （2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，各1 μL上、下游引物（20 μmol/L），0.5 μL LA Taq（5 U/μL），35.5 μL ddH2O。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 7 min。

1.4 克隆与测序

PCR扩增产物经凝胶电泳检测后，采用试剂盒切胶回收，将回收的目的片段与pEASY-T3载体连接，于25 ℃连接15 min。然后将连接产物导入Trans1-T1感受态细胞，冰浴30 min，热激30 s，再冰浴2 min。完成连接转化后，加LB液体培养基于37 ℃摇菌复苏，然后均匀涂抹在LB固体培养基上，37 ℃恒温培养过夜。最后挑选阳性克隆样品送苏州金维智生物科技有限公司进行测序。

1.5 序列分析

通过NCBI中的BLAST软件对测序获得的序列与GenBank 中的序列进行同源性比对，以确定其为正确序列。用DNAMAN软件对样品进行多序列比对，手工调整个别碱基。通过MEGA6.06软件计算序列两两之间的遗传距离并构建ML系统进化树[18]，自举重复数为1 000，其他参数均为默认值。系统进化树所用到的序列名称和登录号见表3。

2 结果与分析2.1 28S rDNA、IGS序列的PCR扩增

以 ITS-LF/LR1为引物，连云港（LYG）、南通（NT）、南日岛1、南日岛2（NRD1、NRD2）、南澳1、南澳2、南澳3（NA1、NA2、NA3）的海水红毛菜基因组DNA为模板，均成功扩增出1条大小约2 100 bp的目的条带（图1-a）。以威海（WH）的海水红毛菜基因组DNA为模板，扩增获得的PCR产物为单一明亮条带，大小约为2 000 bp（图1-b）。以I2LF/I2LR为引物，娘子关（NZG）、兴隆山（XLS）的淡水红毛菜基因组DNA为模板，扩增获得大小约2 400 bp的单一明亮条带（图1-c）。以 IGSF1/IGSR1为引物，海水红毛菜（除WH以外）基因组DNA为模板，扩增获得的PCR产物为单一明亮条带，大小约为1 600 bp（图1-d）。

在NCBI中进行比对，确定其为红毛菜的28S rDNA序列，剪去上游5.8S rDNA、ITS区序列后，获得不同地理群红毛菜的28S rDNA序列长度分别为：威海（WH）的海水红毛菜为1 514 bp，其他7个海水红毛菜均为1 541 bp，淡水红毛菜均为1 855 bp。江苏省、福建省、广东省的7个海水红毛菜扩增获得的IGS序列与福建莆田的海水红毛菜IGS序列（KR010939）比对后，相似性极高，约为99%，因此确定它们为海水红毛菜的IGS序列，且不同地理群海水红毛菜的IGS序列长度为1 645～1 646 bp。

2.2 不同地理群28S rDNA、IGS序列的比对分析

将不同地理群测序获得的28S rDNA序列比对后，对齐剪切，用MEGA 6.06生物信息学软件计算序列的遗传距离。由表4可见，在海水种群中，连云港（LYG）、南通（NT）、南日岛2个品种（NRD1、NRD2）、南澳3个品种（NA1、NA2、NA3）的7个海水红毛菜之间遗传距离为0～0.004，其中连云港（LYG）、南澳1（NA1）、南澳3（NA3）的28S rDNA序列相同。威海（WH）的海水红毛菜与其他采集点的7个海水红毛菜之间的遗传距离为0.144～0.147。娘子关（NZG）、兴隆山（XLS）的2个淡水红毛菜之间的遗传距离为0.001。淡水红毛菜与海水红毛菜之间的遗传距离较远，其中与威海（WH）的海水红毛菜的遗传距离为0.125，与其他7个海水红毛菜的遗传距离为0.210～0.213。根据上述结果分析，初步推测连云港（LYG）、南通（NT）、南日岛2个品种（NRD1、NRD2）、南澳3个品种（NA1、NA2、NA3）的海水红毛菜为1个类群，进而采用进化速率较快的IGS序列对这些地理群的海水红毛菜进行分析，结果见表4。可以看出，采自江苏省、福建省、广东省的7个海水红毛菜的IGS片段序列遗传距离极近，为 0～0.003，其中连云港（LYG）、南通（NT）的IGS序列相同。

2.3 基于28S rDNA序列构建的系统进化树

由于GenBank中已有的红毛菜科28S rDNA序列较少，且仅有的几个紫菜序列也只是28S rDNA上游序列，因此选取长度适宜的紫菜28S rDNA序列与本研究中的红毛菜28S rDNA上游序列进行系统进化树的构建。石花菜目Capreolia implexa（AF039545）为外类群，系统进化树见图2。可以看出：连云港（LYG）、南通（NT）、南日岛2个品种（NRD1、NRD2）、南澳3个品种（NA1、NA2、NA3）的7个海水红毛菜归于1个进化分支，置信度为100%；威海（WH）的海水红毛菜单独归于1个大分支上；8个海水红毛菜与紫菜聚类为1支，为2个淡水红毛菜的姐妹分支；娘子关（NZG）、兴隆山（XLS）的淡水红毛菜则归为另1个分支，置信度为100%。

3 讨论与结论

3.1 28S rDNA序列遗传距离和系统进化树分析

国内外关于28S rDNA序列应用于物种分类与进化的研究相对较少，仅有几位研究者对红藻不同物种的28S rDNA进行研究。Freshwater等报道了石花菜目中16个石花菜物种的28S rDNA序列差异度小于rbcL且大于18S rDNA的差异度，介于两者之间，发现其研究价值不亚于18S rDNA、rbcL序列[11，21]。Harper等研究珊瑚藻28S rDNA序列时曾推测，28S rDNA序列具有区分亲缘关系较近的物种的潜能[22]。从本研究数据中可以看出，不同物种间28S rDNA上游序列的遗传距离为0.125～0.213，显然28S rDNA序列在种间及种以上水平的分类鉴定能力较好，验证了Harper等的推测：28S rDNA 具有区分鉴定亲缘关系较近的相关物种的潜能，在未来具有较大的发展前景[9]。

根据红毛菜28S rDNA上游序列比对分析后，10个地理群的红毛菜大致分为3个类群。结合GenBank中已有的紫菜28S rDNA序列构建系统进化树，结果显示，10个地理群红毛菜分为3个进化分支：其中连云港（LYG）、南通（NT）、南日岛2个品种（NRD1、NRD2）、南澳3个品种（NA1、NA2、NA3）的7个海水红毛菜归为1个分支；而威海的海水红毛菜则与其他7个海水红毛菜差异较大，独立归为1个大分支，显示了海水红毛菜的多样性；娘子关（NZG）、兴隆山（XLS）的2个淡水红毛菜则单独归为1个分支，且与海水红毛菜存在明显差异。

3.2 IGS序列遗传距离分析

有研究报道，在种内及种间系统进化分析中，IGS序列的变异率高于ITS1、ITS2[9，23]，一般用于亲缘关系较近的物种或者种内分析。先后有多位研究者对不同物种的遗传多样性等方面进行研究[24-26]。Li等对采自莆田、汕头、宁波3个产地的栽培坛紫菜的部分IGS进行分析，在1 085～1 100 bp的序列中存在55个变异位点，即约5%的变异率，因此推测IGS可以作为红藻种内研究的分子标记[27]。根据红毛菜核糖体基因28S rDNA序列分析结果及系统进化树，可以确定采自江苏省、福建省、广东省的7个海水红毛菜是同一类群，利用部分IGS序列对这7个海水红毛菜的种内亲缘关系进行分析。IGS序列遗传距离的分析结果显示，7个地理群的海水红毛菜遗传距离极近（0～0.003），几乎没有差别，因此可以认为这7个地理群的海水红毛菜关系紧密，可能为同一物种。

结合不同地理群红毛菜核糖体28S rDNA、IGS序列分析结果及基于28S rDNA构建的系统进化树可知，本研究中采集到的红毛菜具有物种多样性，淡水红毛菜与海水红毛菜之间存在明显区别，海水红毛菜存在遗传多样性，且采自江苏省、福建省、广东省的7个海水红毛菜之间关系紧密，可能由1个物种起源而来。从目前数据可知，28S rDNA可以用于红毛菜种及种以上水平分类研究。此外，由于目前红毛菜和紫菜等红藻的28S rDNA序列的数据有限，将来仍需更多研究来补充和完善此系统进化树，为研究红毛菜科物种多样性、遗传多样性以及保护红毛菜的种质资源提供参考。

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