猪圆环病毒2型泰州株的分离鉴定

郭广富+曹军平+朱爱萍+金彩莲+戴丽红+陶宏卫

摘要：2011年9月，泰州某猪场暴发疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征传染性疾病。采集发病猪腹股沟淋巴结、脾脏和肺脏组织，研磨成组织混悬液，经PCR检测、阳性产物测序，阳性病料悬液经0.22 μm滤膜过滤后接种PK15细胞，连续盲传5代后收取细胞病毒液并提取DNA，PCR检测及间接免疫荧光鉴定，结果表明，该分离株为猪圆环病毒2型（PCV2），命名为TAIZ110926株，目标序列提交给NCBI，获得了序列号：KF039888。

关键词：猪圆环病毒2型；分离；鉴定；目标序列

中图分类号： S858.285.3

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0294-02

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是迄今为止发现的一种最小的动物病毒，具有猪圆环病毒1型（PCV1）和猪圆环病毒2型（PCV2）2种基因型。PCV2感染猪群能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、猪皮炎和肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、猪呼吸道疾病综合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）及怀孕母猪繁殖障碍（sow abortion and mortality syndrome，SAMS）等[1]。血清学和病原学调查证实，PCV2呈世界性分布，给养猪业造成了巨大的经济损失[2-3]。本研究通过对泰州市某猪场疑似PMWS患猪采集肺脏及淋巴结等组织病料进行PCV2的分离、鉴定，以期为今后深入研究和科学防控该病提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征猪的腹股沟淋巴结、脾脏和肺脏等组织，于2011年9月26日采自泰州市某猪场。无PCV污染的PK15由江苏省动物流行病学研究中心保存。基因组DNA快速抽提试剂盒（动物）、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2及10×PCR buffer均为上海生工生物工程有限公司产品，100 bp DNA Ladder和6×DNA 凝胶载入染料（Loading Dye）购自Fermentas公司。猪源抗PCV2阳性血清，购自VMRD公司；羊抗猪IgG-FITC，购自SANTN CRUZ公司。胰酶细胞消化液，购自上海碧云天生物技术有限公司；新生牛血清和DMEM培养基购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 引物的设计与合成

根据文献[4]的方法，合成1对PCV2引物，片段针对PCV2 ORF2基因中的一段序列，长487 bp。引物序列为上游引物：5′-CTgTTTTCgAACgCAgTgCC-3′；下游引物：5′-gCATCTTCAACACCCgCCT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 病料处理

将采集的脾脏、淋巴结和肺等病变组织，研磨研碎，按1 ∶5 加入无菌含双抗的PBS溶液，混匀，反复冻融3次，离心取上清，用孔径0.22 μm滤器过滤后，-20 ℃保存备用。

1.4 病料的PCR检测和测序

用基因组DNA快速抽提试剂盒，按说明书上的操作方法提取组织病料DNA。以提取的组织病料DNA为模板进行PCR扩增，PCR采用50 μL反应体系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 μmol/L上下游引物各1 μL，用灭菌超纯水补足50 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。用15 g/L琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察电泳图谱，拍照记录结果。

PCR产物的回收和纯化：PCR产物电泳后，按Agrose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）说明书进行，回收纯化预期大小的靶片段。

PCR产物的克隆、鉴定、序列测定：取3.2 μL回收纯化产物与pGEM-T easy vector载体（Promega）4 ℃过夜连接。连接产物转化至DH5α感受态细胞，在IPTG+X-gal+Amp的LB平板上筛选白斑，常规方法小量提取质粒。质粒初步电泳验证后，进行PCR鉴定。选择阳性克隆，送南京Genscript公司在ABI 3720 DNA测序仪上测序：T7和SP6或M13+和M13-双向测序。

基因序列比对：采用Lasergene 7.1版（DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA）进行序列的拼接编辑；使用NCBI网站提供的BLAST程序，查找同源率最高的核苷酸序列以进行验证。

1.5 病毒的分离培养

将上述“1.3”节处理的经PCR检测呈PCV2阳性的病料悬液接种于长至半融合状态的PK15细胞上，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗涤2次，加入维持液于37 ℃、5%CO2培养箱中培养72 h，收集细胞反复冻融3次后，取上清继续在PK15细胞上盲传5代。

1.6 病毒的间接免疫荧光鉴定

将第5代分离株接种于长满单层的PK15细胞，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗涤2次，加入维持液于37 ℃、5%CO2培养箱中培养72 h；同时以未接种病毒的PK15细胞作为阴性对照。待检细胞使用PBS洗涤3次，冰甲醇室温固定30 min；PBS洗涤3次，加入PCV2一抗（猪PCV2阳性血清），37 ℃孵育1 h；PBS洗涤3次，再加入FITC标记的羊抗猪二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次后，置于Olympus倒置荧光显微镜下观察。

2 结果与分析

2.1 病料的PCR检测和测序

对疑似PCV2感染猪组织病料提取DNA，进行PCR检测，扩增出片段大小为487bp的目的条带，与预期的结果相符（图1）。

将图1所示靶片段回收纯化连接测序，获得了预期大小487 bp的序列，提交给NCBI，获得了序列号：KF039888。通过BLAST，发现本研究所测毒株序列与GenBank中Porcine circovirus 2 isolate PCV-Y21 （KC515013）的核苷酸同源性最高（99.8%），说明它们的相关基因起源可能相同。

2.2 病毒的分离培养

接种病料的PK15细胞培养72 h无细胞病变，而且盲传5代也没有出现。

2.3 细胞培养物的PCR检测

第5代细胞毒液抽提DNA后经PCR检测，能够扩增出487 bp大小的特异性片段（图2）。

2.4 病毒的间接免疫荧光鉴定

在细胞培养物中观察到了典型的特异性绿色荧光，未接种PCV2病毒的PK15细胞没有观察到任何特异性荧光。结果表明，该分离株为PCV2。将分离的PCV2命名为TAIZ110926株（图3、图4）。

3 结论与讨论

PCV2主要侵害机体的免疫系统，造成免疫抑制、免疫能力下降，从而有利于其他病原体的并发或继发感染。PCV2在世界范围内广泛流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。我国是一个养猪大国，因而对该病病原的深入研究具有非常重要的意义。

感染猪的许多组织（如淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏或肝脏）内含有PCV2病毒粒子，可采用细胞培养的方法分离该病毒。PK15细胞是目前用于PCV2病毒分离的主要细胞系。由于PCV2在PK15细胞上虽能生长，但不产生细胞病变，因而需要结合其他方法来确认PCV2的存在。一般借助PCR、间接免疫荧光试验或电子显微镜观察，以确认病毒分离结果。

本试验将PCR检测后PCV2阳性的病料经研磨、过滤，接种PK15细胞，连续盲传5代后进行PCR检测及间接免疫荧光鉴定，结果成功分离出泰州株PCV2。该毒株的获得，为今后深入研究该病毒的分子生物学特性及开发有效的免疫制剂提供了科学的参考依据。

参考文献：

[1] Grau-Roma L，Fraile L，Segales J.Recent advances in the epidemiology，diagnosis and control of diseases caused by porcine circovirus type 2 [J]. Vet，2011，187（1）：23-32.

[2]Gillespie J，Opriessnig T，Meng X J，et al. Porcine circovirus type 2 and porcine circovirus-associated disease [J]. J Vet Intern Med，2009，23（6）：1151-1163.

[3]Opriessnig T，Meng X J，Halbur P G. Porcine circoviruses type 2 associated disease：update on current terminology，clinical manifestations，pathogenesis，diagnosis，and intervention strategies [J]. J Vet Diagn Investig，2007，19：591-615.

[4]胡 慧，贾艳艳，杨春华，等. 多重PCR检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的研究[J]. 河南农业大学学报，2010，44（4）：421-424.高 峰， 房兴堂，顾斐翠. 三合激素、甲睾酮对雏鸡鸡冠及内脏器官发育的影响[J]. 江苏农业科学，2016，44（4）：296-298.