棉花枯萎病菌拮抗内生菌的筛选和拮抗效果检测崔

崔郑龙++柴秀娟++孔德真+王爱英

摘要：从甘草、阿魏、苦豆子中筛选出4株对棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）抑制效果较好的内生菌，通过其生理生化检测、16S rDNA序列分析进行鉴定；选择抑菌效果最好的拮抗菌A，分别测定其胞内、胞外分泌物的抑菌效果，并检测该菌株对棉花种子萌发和活性氧酶系统的影响。结果表明，拮抗菌A为解淀粉枯草芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），其胞内分泌物对枯萎病菌菌丝生长、产孢、孢子萌发的平均抑制率均高于胞外分泌物。拮抗菌A处理棉花可提高其成活率，但不引起植株系统诱导抗性。拮抗菌A的主要抑菌物质存在于细胞内，抑制产孢是其主要拮抗途径。

关键词：棉花枯萎病菌；拮抗菌；胞外分泌物；胞内分泌物；抑菌效果

中图分类号： S435.621.2+4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）02-0158-06

收稿日期：2015-01-19

基金项目：校企合作项目横向课题（编号：0257-5001601）。

作者简介：崔郑龙（1989—），男，硕士研究生，主要从事微生物资源研究。E-mail：1449006648@qq.com。

通信作者：王爱英，硕士，副研究员，主要从事植物基因工程与安全性评价、微生物资源筛选研究。E-mail：way-sh@126.com。棉花枯萎病是棉花的主要病害之一，其病原菌为尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fusarium oxysporium f.sp.vasinfectum）。这种真菌在自然条件下很容易存活，主要通过土壤、种子、肥料进行传播[1]。长期使用化学药剂控制土传性病害会提高种植成本，加重环境污染。轮作、晒土、深耕等方法虽能减少污染，但很难满足日益增长的生产需求[2]。通过生物防治方法来控制棉花枯萎病，具有可持续性强、减少环境污染等优点，发展前景广阔。植物内生细菌和维管束中导致植物萎蔫的病原菌有相似的生态位，是生物防治的潜在资源。目前，研究人员已经从甘草[3]、大蒜[4]、香蕉[5]、棉花[6]、茶树[7]等上百种植物中分离出具有抑制病原真菌作用的内生菌，但对于拮抗菌抑菌机理的研究仍然处于初步阶段。研究表明，植物内生菌主要通过生态位和营养的竞争、分泌抑菌物质、诱导寄主抗性来抑制植物病原菌生长。有些内生细菌产生的植物激素、磷酸盐、黄酮类物质、抗生素复合物、挥发性有机物可抑制病原菌定植，这也是细菌在植物体内竞争生存空间的一种有效机制[8-10]。植物产生化合物的不同将影响植物内生菌群落的差异，植物的防卫反应对其内生菌种群变化具有一定影响，是抵御相关真菌入侵的重要途径之一[11]。优势菌株繁殖将通过激活植物防御反应，从而影响其他微生物的种群变化。乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）和苦豆子（Sophora alopecuroides Linn.）都属于多年生豆科草本植物，阿魏（Ferula asafoetida）属于多年生伞形科草本植物。龚明福等和毕江涛等已经分别从苦豆子、甘草中分离出了抑制枯萎病菌的内生菌，但研究较为初步[12-13]。本研究中的甘草、阿魏、苦豆子采集于新疆维吾尔自治区石河子市。该地区属于半干旱地区，土壤盐碱化较为严重，从中筛选出抑制枯萎病菌的内生菌，选择抑制效果最好的拮抗菌A，分别检测胞外、胞内分泌物的抑菌效果及其对棉花种子萌发的影响，并测定处理后棉花叶片中多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的变化情况，旨在为阐明棉花枯萎病菌抗内生菌的抑菌机制和分离抑菌物质提供依据。

1材料与方法

1.1供试材料及培养基

采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）分离纯化植物内生细菌，采用LB培养基富集拮抗菌，采用查式一号培养基富集培养病原真菌，采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）作为拮抗性试验培养基。供试材料：乌拉尔甘草、阿魏、苦豆子采集于石河子大学北区试验田，棉花品种为新陆早7号，棉花枯萎病病原菌、棉花种子由石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室提供。

1.2植物内生菌的分离

分别选取甘草、阿魏、苦豆子主茎基部向上10～15 cm的茎段、向下10～15 cm的根段以及健康饱满的叶片，分别用75%乙醇浸泡30 s，1%HgCl2浸泡3 min，无菌水冲洗4～5遍，用无菌滤纸吸干水分。将根和茎切成5 mm长小段，叶片剪成条状，分别接种在NA平板中，每板5个，28 ℃培养2～3 d。将生长出的细菌进行纯化培养，保存待用。

1.3棉花枯萎病拮抗菌的筛选

初筛：将棉花枯萎病病原菌在查氏一号液体培养基中活化培养3 d，沾取菌体悬浮液接种在PDA平板中央，28 ℃培养3 d。挑取分离到的甘草内生菌接种在枯萎病菌菌落的四周，每个平板接种4个点，28 ℃培养3～5 d，选取周围有明显抑菌圈的细菌进行复筛。光学显微镜下观察枯萎病菌形态结构变化。复筛：将培养3 d的枯萎病菌培养液用4层纱布过滤，用显微计数法测定其孢子浓度。在PDA平板中加入200 μL 枯萎病菌的孢子悬液，涂布均匀。平板中间打直径5 mm 的孔并封住孔底。将初筛的生防菌在NA液体培养基中28 ℃培养48 h，取40 μL生防菌发酵液置于孔内（无菌水为对照）。每处理重复 3次，4 ℃存放16 h，28 ℃培养3～5 d后测量抑菌圈大小。

1.44种拮抗菌的鉴定

1.4.1生理生化检测4种拮抗菌的生长曲线、最适pH值、糖发酵、淀粉水解试验、革兰氏染色试验[14]。

1.4.2拮抗菌的16S rDNA鉴定采用CTAB法[15]提取拮抗菌 DNA，采用细菌16S rDNA的通用引物扩增引物，F5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系：DNA模板3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPmix 2 μL，相应的引物10 μmol/L各1 μL，TaqDNA聚合酶5 U/μL 0.5 μL，ddH2O 16 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保温24 h。PCR产物经1%的琼脂塘凝胶电泳分析，委托华大基因公司进行测序。序列GenBank数据库分析比对，运用ClustalX 2.0、MEGA 5.10软件建立系统发育树。

1.5拮抗菌A胞外、胞内分泌物对枯萎病菌的影响

1.5.1拮抗菌A胞外、胞内分泌物的制备选择拮抗效果最好的拮抗菌A置于LB培养基中，28 ℃ 200 r/min 分别培养6、9、12、15、18 h，测量菌液在600 nm处的吸光度，确定其浓度。取40 mL菌液于50 mL试管中，6 000 r/min 离心10 min。上清液过滤除菌（0.22 μm），得到含有胞外分泌物的溶液。沉淀中加入10 mL 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH值7.2），充分混匀，冰浴超声波破碎细胞，得到含有胞内分泌物的溶液。将含有胞外、胞内分泌物的溶液涂布于LB平板上，确定无活菌体存在。

1.5.2胞外、胞内分泌物对枯萎病菌菌丝生长的影响将含有胞外、胞内分泌物的溶液分别稀释1、10、100倍，各取100 μL稀释液与融化的PDA培养基混匀于平板中。完全凝固后，用0.5 cm的打孔器取枯萎病菌菌饼放于平板正中央。每个菌株胞内外分泌物重复3次，以加入无菌水为对照，28 ℃培养4 d，测量枯萎病菌菌落的直径，计算抑制率。

1.5.3胞外、胞内分泌物对枯萎病菌产孢的影响将枯萎病菌菌丝块接种于PDA培养基中央，28 ℃培养至菌落直径达4.5 cm，挖除周围培养基，分别取上述胞外、胞内分泌物稀释液20 mL倒入平板处理20 min（无菌水为对照），倾去溶液，28 ℃继续培养3～5 d至孢子产生，每平板用10 mL无菌水将孢子洗下，4层纱布过滤得孢子悬浮液，显微观察记录孢子数，并计算产孢抑制率。

1.5.4胞外分泌物与胞内分泌物对枯萎病菌孢子萌发的影响取50 μL上述胞外、胞内分泌物稀释液置于凹玻片凹槽中（无菌水作为对照），加入50 μL枯萎病菌孢子悬浮液，混合后用盖玻片盖严，28 ℃恒温培养。分别在0、4、8、12、16、20、24、28 h镜检孢子萌发情况，测量孢子的长度。每样品重复 4 次，每次重复检查5个视野，记录数据并计算孢子萌发的平均长度。

1.6拮抗菌A对棉花的影响

1.6.1拮抗菌A对棉花种子萌发的影响采用70%乙醇清洗棉花种子30 s，无菌水冲洗3～4次，每次5 min，分装于平板中，每个平板30粒种子。取20 mL拮抗菌A培养液浸泡种子10 min（无菌水作对照），倾去培养液，无菌水清洗3次，每次20 mL。25 ℃恒温保湿培养，3 d后调查种子萌发率。

1.6.2棉花活性氧酶系统分析按照草炭土、珍珠岩、蛭石为2 ∶1 ∶1的比例配制土壤，将棉花枯萎病菌孢子悬液（30 mL/盆）混合在土壤中（蒸馏水作对照）。将棉花种子用70%乙醇表面消毒30 s，用蒸馏水冲洗3～4次，每次5 min，用拮抗菌A培养液浸泡种子10 min（无菌水作对照），倾去培养液，清洗3次，室温（23 ℃）浸泡24 h，播种在直径为20 cm的营养钵中，每钵播种10粒，常规管理。播种后第20天计算成活率，之后每盆补加拮抗菌A培养液10 mL于土壤中，菌液浓度为 106 CFU/mL，以蒸馏水作为对照。播种后第40天、第50天、第60天、第70天分别测定POD、PPO、PAL活性[16]。

2结果与分析

2.1棉花枯萎病拮抗菌的分离和筛选

分离得到来自甘草、阿魏、苦豆子不同植株部位的内生细菌共计25株，其中有11株来自甘草，5株来自阿魏，9株来自苦豆子。筛选得到7株对枯萎病菌有抑制作用的内生菌，选择了4株抑菌效果较好的菌株进行复筛（表1）。显微观察抑菌圈附近的菌丝形态，发现有明显的变形（图1）。菌株A初筛的抑菌效果最佳，抑菌圈直径为26.96 mm，与其他菌株差异显著。菌株B在复筛中表现出较大的抑菌圈，但和A菌株抑菌圈直径无显著差异。

2.24株拮抗菌的生长特性

A、B、C、D的生理生化检测结果表明，4株拮抗菌的最适pH值都偏酸性，A、B、C为革兰氏阳性菌，D为阴性菌（表2）。

2.3拮抗菌的16S rDNA鉴定

菌株A、B、C、D的16S rDNA序列通过邻位相接法建立的系统发育树（图2）。A与Bacillus amyloliquefaciens较相似，遗传距离为1.972。B与Bacillus tequilensis较相似，遗传距离为0.009。C与Bacillus sp. 较相似，遗传距离为1.970。D与

2.4拮抗菌A胞外、胞内分泌物对枯萎病菌的影响

2.4.1胞外、胞内分泌物对枯萎病菌菌丝生长的影响拮抗菌A胞外、胞内分泌物对枯萎病菌菌丝生长的平均抑制率分别为8.55%、9.41%（图3-a）。抑制率随着菌液浓度的增加而增加，富集18 h的胞外分泌物对菌丝生长的抑制率达27.60%；富集15 h的胞内分泌物抑制率达32.93%（图3-a、图3-b）。胞外、胞内分泌物的最大抑制率均出现在细菌生长的稳定期。

2.4.2胞外、胞内分泌物对枯萎病菌产孢的影响拮抗菌A胞外、胞内分泌物对枯萎病菌产孢的平均抑制率分别为26.32%、40.14%（图4）。胞外分泌物的抑制率在对数期中后期有一定下降，在稳定期达最大值，富集18 h的胞外分泌物抑制率达72.29%；胞内分泌物的抑制率在对数期早期显著增加并达到最大值，对数期中后期逐渐稳定，稳定期有所回落，富集9、15 h的胞内分泌物抑制率达88.81%。

2.4.3胞外、胞内分泌物对枯萎病菌孢子萌发的影响孢子萌发长度随培养时间的增加而增加（图5-a），富集9 h的胞外分泌物在孢子萌发24 h时抑制率最大，达到23.15%；富集15 h的胞内分泌物在孢子萌发28 h时抑制率最大，达到26.09%。显微观察发现，胞外、胞内分泌物处理枯萎病菌后，部分孢子在萌发时，出现了菌丝畸形、断裂的现象，其中胞内分泌物处理后变化比较明显（图5-b）。

2.5拮抗菌A对棉花生长的影响

2.5.1拮抗菌A对棉花种子萌发的影响拮抗菌A处理对棉花种子湿质量、干质量、发芽率并无显著影响，但对其成活率具有显著影响（表3）。单独用拮抗菌A处理过的种子成活率增至48.33%，单独用枯萎病菌处理的种子成活率下降至

35.83%，均与对照差异显著。拮抗菌A与枯萎病菌共同作用时，棉苗的成活率与对照一致。

2.5.2棉花POD、PPO、PAL分析棉花播种40 d，共同用拮抗菌A和枯萎病菌处理组的PAL活性显著提高，单独用A或枯萎病菌处理的棉花PAL活性也与对照差异显著。其他处理下PAL、POD 、PPO活与对照差异不显著（表4）。

3结论与讨论

目前应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞杆菌属（Pseudomonas）、土壤放射杆菌（Agrobacterium radiobacter）等。其中芽孢杆菌属具有抗逆性强、抗菌谱广等特点，是植物微生态体系中的优势微生物种群，是理想的植物病害生防细菌来源之一[17]。本研究得到的抑菌效果最好的拮抗菌A为解淀粉枯草芽孢杆菌，分离自甘草的叶片，它增

殖速度快，富集12 h菌浓度可达108 CFU/mL，枯萎病菌达到这一浓度需要在相同条件下富集72 h，这使得拮抗菌A能够在植物中占据优势地位。

枯草芽孢杆菌的生防作用机制多样，主要有竞争、拮抗、溶菌、诱导植物抗病性和促进植物生长等[18]。已经有学者从拮抗内生菌发酵液中分离出了抑制枯萎病菌的物质，这些抑菌物质主要包括化合物[19]、脂肽[2]、糖类[20]、蛋白[21]，这些物质的分泌对于拮抗菌在植物中占据有利地位起到了关键作用。枯草芽孢杆菌分泌产生的抑菌蛋白对植物病原菌抑制作用机制包括抑制病原菌孢子产生、萌发，导致菌丝畸形，细胞壁溶解和原生质泄露。本研究从抑制枯萎病菌菌丝生长、产孢、孢子萌发3个方面检测胞外、胞内分泌物的抑菌活性，发现其抑制产孢的作用较为明显。虽然通过显微观察发现胞内、胞外分泌物也能引起菌丝畸形、孢子萌发迟缓，但抑制率

远远低于对产孢的抑制率，因此抑制产孢可能是胞内、胞外分泌物的主要抑制途径。此外，同种细菌在不同的生长时期，其胞内各种酶的活性、营养需求及代谢产物均有一定差异。细菌在接近稳定期时，次生代谢产物开始积累[22]。本研究的最佳抑制率出现在对数期，且胞内分泌物在抑制菌丝生长、产孢、孢子萌发3个方面均高于胞外分泌物，可能意味着这种抑菌物质并非拮抗菌A的最终代谢产物。对数期抑菌物质的合成有助于细菌提前占据优势，抑制枯萎病菌的发展。

植物抗病性反应可以通过植物体内活性氧酶的活性变化来反映，这些酶包括PPO、POD、PAL、超氧化物歧化酶（SOD）、β-1，3-葡聚糖酶等[23]。很多拮抗菌通过激活植物防御反应，从而在植物中占领生存空间，这种机制提高了植物对于病原菌的抵御能力。枯草芽孢杆菌TR21可诱导香蕉防御反应，枯草芽孢杆菌B29、解淀粉芽孢杆菌K103均可诱导黄瓜防御反应[24-26]。并非所有拮抗菌都能引起植物的防御反应。本研究测定了POD、PPO、PAL 3种酶在拮抗菌A处理棉花种子后的酶活变化情况，发现棉花播种40 d，共同用拮抗菌A和枯萎病菌处理组的PAL活性显著提高，单独用拮抗菌A或枯萎病菌处理的棉花PAL活性也与对照差异显著，其他处理下PAL、POD 、PPO活性与对照差异不显著。可以推测拮抗菌A并没有引起棉花的系统诱导抗性，可见引起植物系统诱导抗性并不是拮抗菌A的主要抑制途径。

参考文献：

[1]赵帅，杜春梅，田长彦. 黄瓜枯萎病综合防治研究进展[J]. 中国农学通报，2014（7）：254-259.

[2]Wang X，Liang G. Control efficacy of an endophytic Bacillus amyloliquefaciens strain BZ6-1 against peanut bacterial wilt，Ralstonia solanacearum[J]. Biò Med Research International，2014，12：1-11.

[3]刘建利，曹君迈，马文平. 宁夏乌拉尔甘草内生菌鉴定及甜瓜采后病害病原拮抗菌的筛选[J]. 干旱地区农业研究，2011，29（1）：252-256.

[4]韦智钟，刘梦雅，李真，等. 大蒜内生菌的分离及其抑菌作用的研究[J]. 黑龙江农业科学，2013（12）：5-9.

[5]胡伟，赵兰凤，张亮，等. 香蕉枯萎病生防菌AF11的鉴定及其定殖研究[J]. 中国生物防治学报，2012，28（3）：387-393.

[6]周燚，杨廷宪，王斌先，等. 棉花内生拮抗菌Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1抗黄萎病研究[J]. 棉花学报，2012，24（1）：71-77.

[7]Aimé S，Alabouvette C，Steinberg C，et al. The endophytic strain Fusarium oxysporum Fo47：a good candidate for priming the defense responses in tomato roots[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2013，26（8）：918-926.

[8]Khan Z，Kim S G，Jeon Y H，et al. A plant growth promoting rhizobacterium，Paenibacillus polymyxa strain GBR-1，suppresses root-knot nematode[J]. Bioresource Technology，2008，99（8）：3016-3023.

[9]Minerdi D，Bossi S，Gullino M L，et al. Volatile organic compounds：a potential direct long-distance mechanism for antagonistic action of Fusarium oxysporum strain MSA 35[J]. Environmental Microbiology，2009，11（4）：844-854.

[10]Ryan R P，Germaine K，Franks A，et al. Bacterial endophytes：recent developments and applications[J]. FEMS Microbiology Letters，2008，278（1）：1-9.

[11]Saunders M，Kohn L M. Evidence for alteration of fungal endophyte community assembly by host defense compounds[J]. The New Phytologist，2009，182（1）：229-238.

[12]龚明福，韩松，李超，等. 苦豆子根瘤内生细菌分离及其对棉花枯萎病的生物防治效果测定[J]. 微生物学通报，2011，38（6）：865-870.

[13]毕江涛，王小霞，陈卫民，等. 甘草内生真菌分离及其抑菌活性初探[J]. 草业科学，2013，30（3）：357-364.

[14]范秀容，沈萍. 微生物学实验[M]. 北京：人民教育出版社，1980：275-276.

[15]王娜. 棉花黄萎病、枯萎病拮抗细菌的筛选及相关抗病基因的克隆[D]. 北京：中国农业科学院，2007.

[16]中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生理学会.现代植物生理学实验指南[M]. 北京：科学出版社，1999：415-416.

[17]李姝江，朱天辉，谯天敏，等. 松烂皮病内生拮抗细菌的筛选、生防效果及华山松的生理响应[J]. 植物保护学报，2014，41（5）：569-577.

[18]黄海婵，裘娟萍. 枯草芽孢杆菌防治植物病害的研究进展[J]. 浙江农业科学，2005（3）：213-215，219.

[19]Xu Y，Zhong J J. Significance of oxygen supply in production of a novel antibiotic by Pseudomonas sp. SJT25[J]. Bioresource Technology，2011，102（19）：9167-9174.

[20]El Hadrami A，Adam L R，El Hadrami I，et al. Chitosan in plant protection[J]. Marine Drugs，2010，8（4）：968-987.

[21]孙瑶，李宝庆，马平. 棉花黄萎菌拮抗细菌BDT-25抑菌蛋白的分离纯化[J]. 河北农业科学，2011，15（6）：42-45，49.

[22]张晓云，李宝庆，郭庆港，等. 生防枯草芽孢杆菌CAB-1抑菌蛋白产生条件及其稳定性研究[J]. 中国农业科技导报，2011，13（2）：59-64.

[23]林陈强，李占飞，张慧，等. 枯草芽孢杆菌CS16诱导香蕉抗病性相关防御酶系的研究[J]. 福建农业学报，2013，28（6）：570-574.

[24]喻国辉，周林，程萍，等. 枯草芽孢杆菌TR21对香蕉抗病相关基因表达的诱导作用[J]. 中国生物防治学报，2012，28（1）：152-156.

[25]张先成，张云湖，赵晓宇，等. 枯草芽孢杆菌B29菌株对黄瓜植株的诱导抗性[J]. 武夷科学，2009，25（12）：24-29.

[26]张宝. 解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽Bacillomycin L.的纯化鉴定及抑菌机理研究[D]. 北京：中国农业大学，2014.袁梦思，李建文，刘梦华，等. 1株不动杆菌发酵液对水稻纹枯病菌的抑菌作用[J]. 江苏农业科学，2016，44（2）：164-165.