外源褪黑素对离体培养虎杖生长的影响

张来军+贾敬芬+王凤琴等

摘要： 研究不同浓度外源褪黑素[N-acetyl-5-methoxytryptamine，即melatonin（MEL）]对离体培养虎杖茎生长、根分化的影响。在培养基中分别添加3、6、12、24 μmol/L MEL，观察其对扦插的虎杖外植体生长的影响，并用相应浓度的IAA（indole-3-acetic acid）作对照。结果表明，各种浓度的MEL对虎杖的生长都产生明显影响，低浓度的MEL（3、6 μmol/L）有助于茎、根的生长，其中在6 μmol/L MEL作用下根长、根数、茎高、叶面积、生根率均达到最大或较大值；高浓度MEL（24 μmol/L）对虎杖生长有抑制作用。由结果可以看出，MEL可以调节离体培养虎杖的生长，其对虎杖生长的促进作用与IAA类似。

关键词： 褪黑素；IAA；虎杖；组织培养；离体培养

中图分类号：Q946.885+.9；S567.23+9.043 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2015）08-0058-03

自1995年在植物体中发现褪黑素[N-acetyl-5-methoxytryptamine，即melatonin（MEL）] [1]后，植物体内褪黑素的功能成为众多学者研究的热点，迄今为止研究已经取得了很大进展，但是褪黑素在植物中作用的详细机制还须要进一步研究。关于MEL的最初研究集中于对不同植物及植物的不同器官含量的测定 [2-3]，随后一些报道揭示，MEL可能作为一种抗氧化剂存在于细菌、真菌、植物 [4-6]中。王英利等发现，外源MEL对增强UV-B辐射下生长的绿豆有防护作用 [7]。Lei等以胡萝卜悬浮细胞为材料进行试验表明，加入外源MEL降低了低温胁迫下细胞的凋亡 [8]。Zhao等报道，MEL提高了低温胁迫下大花红景天（Rhodiola crenulata）愈伤组织的存活率 [9]。一些研究还发现，MEL对植物生长有促进作用 [10]。用外源MEL处理贯叶连翘，促进了根的形成 [11]；Arnao等用高浓度MEL短期处理羽扇豆（Lupinus albus L.）的下胚轴、子叶，发现MEL可以促进下胚轴形成不定根，子叶也显著扩展 [12-13]。由于MEL结构类似于IAA，是一种吲哚类化合物，利用离体培养体系研究外源MEL对植物生长的影响，是方便的研究体系，也为阐明植物体内MEL的生理功能提供了更多的科学证据。虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）为多年生蓼科草本植物，主要分布于秦岭以南地区，以根或根茎入药，其主要有效成分是芪类化合物、蒽醌类化合物，其中芪类化合物主要包括白藜芦醇、白藜芦醇苷。白藜芦醇及其苷类是具有多种药理作用的活性化合物，能够抑制细胞和组织癌变、降血脂、抑菌、抗氧化、抗病毒、增强机体免疫力，还是一种安全的天然植物雌激素，广泛应用于临床医疗及保健业 [14]。将MEL应用于虎杖的扦插培养，可以揭示MEL在植物组织培养过程中对生长可能起到的调节作用，也可为虎杖的组织培养提供新方法。本试验将离体培养的虎杖分别置于附加不同浓度的MEL培养基上培养，并用相应浓度的IAA作对照，观察MEL对离体培养的虎杖茎生长、根分化的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

虎杖外植体取自西北大学生命科学学院果园，经鉴定为虎杖（P. cuspidatum）。取当年新生虎杖的带叶茎段，流水冲洗6～10 h后用75%乙醇处理10～15 s，分别用无菌水冲洗1～2次、0.2%氯化汞溶液消毒5～7 min、无菌水冲洗3～4次，然后在无菌条件下剪掉叶片，剪成1 cm长茎段（留1个腋芽），接种于附加0.1 mg/L 6-BA、1 mg/L GA3、0.5 mg/L IBA的MS培养基上进行培养。培养条件：温度（25±2） ℃，相对湿度60%～75%，人工光照12～14 h/d，光照度30 μmol/（m2·s）。以8周后再生出的无菌苗为试验材料。

1.2 MEL、IAA处理

将虎杖无菌苗切成约1 cm长的茎段，保留1个腋芽，扦插在MS培养基（加B5培养基的有机成分）上。将MEL、IAA过滤灭菌，以不同的终浓度（0、3、6、12、24 μmol/L）加在培养基中，先在（25±2） ℃的暗环境下培养7 d，然后在（25±2） ℃、 相对湿度60%～75%、人工光照时间12～14 h/d、光照度 30 μmol/（m2·s） 的环境下培养。分别在4、6周后，测量根长、根诱导密度、茎的高度、叶片数量、叶面积。相关计算公式如下：

生根率=生根外植体数/接种外植体数×100%；

根诱导密度=生根数/出根外植体数 [14]；

平均根长=根总长/根总数；

平均茎高=总茎高/存活外植体数；

叶面积=总面积/存活外植体数。

1.3 统计分析

每个处理包括4个重复，每个重复由5个外植体组成。统计叶片数量、根的数量，测量根的长度、茎的高度。每株苗的每张叶叶面积用叶面积仪测量，单位cm2。统计形式为“均值±标准误”，所取数据经数理统计分析，各组处理间进行单因素方差分析。试验重复3次。

2 结果与分析

培养7～14 d后，扦插于培养基上的茎段开始出现腋芽，茎开始延长，随后分化出根。培养6周后，将MEL对离体培养虎杖生长的调节作用与相同浓度下的IAA进行统计和对比。

由图1可见，培养基中附加MEL、IAA提高了扦插的虎杖茎段的生根率；对照组（培养基中不加MEL、IAA）的生根率为41.7%，添加IAA的所有浓度梯度下的外植体生根率均大于对照组，MEL仅在浓度为24 μmol/L时的生根率与对照组相近，为40%，其余浓度梯度下的外植体生根率均大于对照组；IAA、MEL浓度为3 μmol/L时生根率达到最大值，分别为1000%、63.7%。

由图2、图3可见，苗的高度、叶面积均与附加的MEL、IAA及其浓度有一定相关性。附加低浓度MEL、IAA的培养基上，平均茎高、叶面积均高于对照组，MEL浓度为6 μmol/L或IAA浓度为3 μmol/L最有利于虎杖的生长，平均茎高、叶面积都达到最大值。其中MEL浓度为6 μmol/L的平均茎高为（7.63±1.45）cm，平均叶面积达到（29.7±10.1）cm2；IAA浓度为 3 μmol/L 的培养基上虎杖茎高为（7.09±1.69）cm，平均叶面积为（31.8±6.55）cm2；对照组的茎高、叶面积分别为（4.07±2.19）cm、（18.99±6.88）cm2；2个处理的叶面积、茎高均显著大于对照组（P<0.05）。但是当MEL、IAA的浓度升高时，虎杖生长受到抑制，MEL、IAA浓度为24 μmol/L时表现出的抑制效应较强，24 μmol/L IAA的培养基上的茎高甚至低于对照组。相同浓度的MEL与IAA相比，MEL所诱导的叶面积虽然基本低于IAA诱导的叶面积，但是彼此间的差异并没有达到显著水平。

MEL、IAA都能诱导出丰富的根，根长、根诱导密度与浓度具有密切关系，根的生长情况见图4、图5。可以看出，低浓度的MEL、IAA促进根的生长，随着浓度的进一步升高，根诱导密度、根长会减少。MEL的浓度为6 μmol/L时，虎杖的根诱导密度、根长达到最大或较大值，外植体根诱导密度为（2.44 ± 1.42）条/个，[CM（16]根长为（2.79 ± 1.20）cm；IAA浓度为 3 μmol/L时，根诱导密度、根长达到较大值，分别为（663±3.46）条/个、（0.95±0.27）cm；对照组的根诱导密度为（1.67±1.53）条/个，根长为（2.66±1.58）cm。此外，MEL、IAA所诱导的根的形态有很大差异，详见图6-A3、图 6-B3、图 6-C3。附加IAA的培养基上，茎段基部膨大，形成类似愈伤组织的结构，根数多且短，根上密被根毛；附加MEL的培养基上，茎段基部没有膨大，根数少而长，主根、侧根形态明显，根的形态与对照组所形成的根极为相似，因此在浓度相同的情况下，MEL诱导所产生的根的长度极显著大于IAA处理组（P<001）（图5）；除24 μmol/L处理外，根诱导密度，即平均生根数极显著低于IAA组（P<0.01）（图4）。

6 μmol/L MEL、IAA对扦插的虎杖茎段生根、芽分化的影响见图6。在附加MEL的培养基上，根分化的时间明显早于对照组、IAA处理组，很多茎段基部在接种1周后开始生根，而附加IAA的培养基上接种2周后才陆续分化出根。

3 讨论

植物组织培养中培养基附加植物生长调节物及其浓度显著影响苗的生长、发育，离体培养虎杖时，与对照组相比，附加

MEL、IAA的培养基上芽生长健壮，叶片数、根数多，或具有更长的根。在本试验中，MEL与IAA的作用类似，均促进了虎杖茎、根的生长，且低浓度的促进效果更为明显。这一现象与用外源MEL诱导羽扇豆下胚轴产生不定根 [12]以及Murch等用MEL促进贯叶连翘根的形成得到的结果 [11]相似；Chen等试验发现，较低浓度的外源MEL提高了芥菜（Brassica juncea）内源IAA的含量，从而推测低浓度的MEL促进根生长的原因是外源MEL激发内源IAA的合成 [15]，而高浓度时对植物生长表现的抑制效果可能是由IAA诱导乙烯合成造成的 [10]。

植物离体再生过程中，外源激素的吸收和代谢影响内源

[FL（2K2]激素的活动，从而影响离体培养物的生长。不同生长素有不同的代谢途径，调节细胞生长和分化的方式与效果存在很大差异，MEL、IAA都为吲哚类化合物，对植物都有生长调节作用，但表现不尽相同。这些试验结果为进一步了解MEL在植物中的功能提供了试验依据。

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