基因工程技术在杨树抗逆境方面的研究进展

主楚杰　王爱云

摘要：阐述了基因工程技术在杨树抗逆遗传改良方面的应用，总结了转基因杨树抗病虫、抗旱、耐盐以及在环境修复中取得的研究成果，讨论了基因工程技术在杨树抗逆方面存在的问题。杨树因长速快、产量高、基因组小等特点，具有较高的经济价值和生态效益，同时也是林木遗传改良的模式树种。尽管对杨树抗逆遗传改良进行了相关研究，但有关外源基因提高杨树抗逆性的机理和应用仍有待进一步深入研究。挖掘新的抗逆基因、培育具有抗性的杨树新品种仍将是今后的研究重点。

关键词：基因工程；杨树；抗逆

中图分类号：S792.110.4 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0010-04

收稿日期：2014-10-16

基金项目：湖南省自然科学基金（编号：13JJ5024）。

作者简介：主楚杰（1990—），男，湖南长沙人，硕士研究生，主要从事植物遗传改良研究。E-mail：zhuchujie@163.com。

通信作者：王爱云，教授，主要从事植物遗传改良研究。E-mail：wangaiyun12@aliyun.com。杨树是重要的速生丰产工业用材、绿化建设、防护林和生物质能源树种之一，具有较高的经济价值和生态效益。杨树的基因组较小，基因组测序已完成，因此，杨树被作为模式林木树种应用于木材的形成、抗逆性遗传改良等方面的研究[1]。20世纪末至21世纪初，我国建造了超过1 000万hm2的速生林基地，杨树占重要部分。随着杨树人工林的大面积推广，杨树的抗逆性明显降低，病虫害的发生和危害逐渐加重，培育杨树抗病新品种迫在眉睫。由于杨树生长周期长、树体高大，采用传统育种方法在短时间内培育抗病新品种较困难。随着分子生物学和基因工程技术的发展，植物抗逆机理研究的深入以及某些抗逆相关基因的克隆和转化，为杨树抗逆遗传改良开辟了一条新途径[2-3]。

1转基因杨树抗病虫研究

1.1抗病研究

1.1.1抗病毒病抗病毒基因工程研究在林业上的应用才刚起步，目前，使用的基因主要有洋李痘病毒的外壳蛋白基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因等几种。Cooper、李玮等分别将花叶病毒外壳蛋白基因和抗菌肽LCI基因导入杨树中，均获得良好抗病效果的转基因植株[4-5]。

1.1.2抗细菌病农杆菌感染杨树后，杨树极易感染冠瘿病。目前，关于杨树抗冠瘿病的研究主要是采用转基因技术将农杆菌致瘤基因、激素IAA基因、抗菌肽基因（兔防御素NP-Ⅰ基因）导入杨树，获得抗性提高的转基因植株[6]。

1.1.3抗真菌病植物受到病原物侵染后，会使多种病程相关蛋白迅速表达，参与其抗病防卫反应。在这些病程相关蛋白中，最主要的蛋白之一就是几丁质酶 [7]，几乎所有的植物器官中均可以发现几丁质酶[8]。在正常情况下，几丁质酶水平很低，但经诱导因子的诱导，表达量可以迅速增加。病原真菌、细菌、病毒的侵染、激发子和一些逆境等均可能诱导植物几丁质酶的表达[9]。近年来，有关对植物几丁质酶的特性、基因结构、分类、分子进化、生物学作用及转几丁质酶基因的研究，已成为植物抗真菌病害的研究热点之一[10-11]。1991年，Broglie等首次对转几丁质酶基因在植物的抗真菌病方面进行了研究，他们将菜豆几丁质酶基因转入烟草和油菜，并得到表达，有效降低了植株的死苗率，控制了病情的发展[12]。但转基因烟草植株对病原真菌的抗性没有明显提高。进一步研究证明，几丁质酶同工酶类型及其在植物体内定位的不同，将影响基因的表达和植株的抗病性。

Nicolescud等分别将矮牵牛黄酮合成酶基因、草酸氧化酶基因、几丁质酶基因导入杨树，均获得了具有一定抗性的转基因植株[13-15]。王琼等以受落叶松-杨栅锈菌单孢子堆菌系Sb052侵染的川杨叶片为材料，采用RACE技术克隆川杨几丁质酶基因DNA全长，通过荧光定量表达分析，推测PsChi I基因参与了寄主川杨抵抗真菌的防御机制[16]。

1.2抗虫研究

食叶害虫和蛀干害虫是危害杨树的2类主要害虫，包括杨尺蠖、舞毒娥、杨扇舟蛾、光肩星天牛、桑天牛、云斑天牛等。目前，国内外用于杨树抗虫基因工程研究的外源基因主要有苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因、抗菌肽基因、昆虫特异性神经蝎毒素基因、几丁质酶基因、多酚氧化酶、脂氧化酶、胆固醇氧化酶，以及Vip3A等，但对于杨树转Bt基因的研究最为深入，发展也最为迅速[17-19]。

1.2.1苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因从苏云金杆菌的芽孢中分离出来的Bt杀虫晶体蛋白，现今已发现60多种，一般用Cry1、Cry2、Cry3、Cry4和Crt来表示，划分的主要依据是由其杀虫谱范围和基因序列的同源性来决定[20]。Bt毒蛋白是一个单基因产物，1981年Schnepf等首次将苏云金杆菌Kurstaki HD-1的Bt毒蛋白基因克隆[21]。该基因的mDNA在植物中表达量较低，不稳定，同时也不会改变原氨基酸序列，从而使这些毒蛋白的基因表达量提高了上百倍[22-23]。鉴于Bt毒蛋白具有高度专一性、生物降解性，且对人畜无害的安全性，被作为转基因植物抗虫基因工程中理想的杀虫目的基因[24]。目前，已有许多转Bt基因植物问世，有的已进入大田试验和商品生产阶段[25]。国内外关于转Bt基因在杨树方面的研究，主要集中在欧洲黑杨、美洲黑杨、欧美杨和杨树杂种NC5339（Populusdehoides alba×P. grandidentata）、NL-80106 （P.×P. simonii）、741杨[P. alba × （P. davidiana+P. simonii） ×P. tomentosa]等品种上，这些转Bt基因杨树均具有一定的抗虫效果[26]。最早见于报道的是用Bt CryIA基因转化欧洲黑杨，通过Southern杂交证明外源基因的成功转入[27]。此后，抗虫转基因研究就拉开了帷幕。广大研究工作者围绕Bt基因[28-33]，以及Bt嵌合基因[34-35]、Bt双元表达载体[36]、Bt双价抗虫基因[37-38]在杨树中的抗虫性进行了广泛研究，并取得了明显的抗虫效果。

1.2.2蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂是对蛋白水解酶有抑制活性的一种水分子蛋白质，普遍存在于植物、动物和微生物中[39]。迄今为止，自然界共发现四大类蛋白抑制剂：丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂。目前，用于转化杨树的主要有丝氨酸蛋白酶抑制剂基因和半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因[40]。McNabb等首次将马铃薯蛋白酶抑制剂基因导入NC5339无性系，转化获得抗虫杨树[41]。Klopfenstein等分别利用马铃薯的蛋白酶抑制剂与NPT，以及大豆丝氨酸蛋白酶抑制剂基因、水稻巯基蛋白抑制剂基因和Bt Cry（A）构成的嵌合基因导入杨树，获得转基因植株[42-43]。郝贵霞等将广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂基因成功地导入了毛白杨，经PCR和PCR-Southern检测证实基因已整合进杨树基因组中[44]。

1.2.3昆虫毒性基因昆虫特异性神经毒素是从胡蜂、蝎子、蜘蛛的毒液中分离到的一些小肽（30～40个氨基酸），是一类作用于昆虫神经系统并具有毒杀作用的蛋白类神经毒素。这类毒素只作用于昆虫而对哺乳动物和其他动物无害或者毒性很小，是一种十分理想的抗虫基因源[45]。伍宁丰等将抗虫的蝎神经毒素基因导入黑杨无性系N-80106中，通过根癌农杆菌将构建在双子叶高效表达载体上的已优化了密码子的AaIT基因转化杨树杂种NL-80106（Populusdeltoides×P. sinonii），得到了转基因植株[46]，通过PCR、PCR-Southern杂交和ELISA分析，证实了转基因植株中AaIT基因的表达，转基因植株对1龄舞毒蛾幼虫的效果最好，具有明显抗虫性。

1.2.4其他抗虫基因近年来，陆续开展了植物凝集素基因、脂氧化酶、多酚氧化酶、胆固醇氧化酶及Vip3A等编码基因在杨树抗虫方面的应用研究，取得了一定的进展[47-48]。

2转基因杨树耐旱研究

我国国土面积有50%以上属于干旱或半干旱地区，这些地区降雨量集中，年降水量介于250～500 mm之间，土壤水分缺失严重。据统计，半干旱区人工造林成活率、保存率大约为30%，而干旱区一般为4%，最高也不会超过20%，严重阻碍了当地林业生产发展和生态环境的改善[49]。

根据基因的作用方式，可将参与杨树干旱胁迫相关基因分为2类：一类是直接参与植物抗旱能力提高的功能基因，包括水通道蛋白、渗透蛋白、Lea蛋白等；一类是起调节作用的蛋白基因，主要包括Bzip、MYC、MYB和DREB等传递信号和调控基因表达的转录因子基因。MAP激酶、CDP激酶、受体蛋白激酶、核糖体蛋白激酶和转录调控蛋白激酶等，以及感应和转导胁迫信号的蛋白激酶基因以及磷酸酯酶、磷酸酶C等蛋白酶基因[50]。目前，关于杨树抗旱研究主要通过克隆松树、柽柳、桦树、栎树等极端抗逆植物的抗旱基因，导入杨树中，获得抗旱性植株。

侯德英等采用根癌农杆菌介导法，将甜菜碱合成酶基因转化，获得转基因植株[51]。通过农杆菌介导法，王沛雅等分别将油菜素内酯生物合成酶基因DAS5、柽柳TabZIP基因、锌指蛋白转录基因、pBI121-chlAPX重组质粒等基因导入杨树中，转基因株系的抗旱性得到提高[52-55]。经过不断研究，转sosl基因山哈杨[56]、转Lea基因小黑杨[57]、转AtDREB1A基因银新杨[58]、转AREB1C基因南林895杨[59]、转Trx基因欧美杨[60]、转基因SacB银腺杂种杨[61-62] 等的抗旱性均有不同程度的提高。崔旭东等采用基因枪法，5个抗旱相关基因——转录因子基因JERF36基因、ZxZF基因、AREB基因和功能基因SacB基因、GST基因的共转化，获得了包含1～4个外源基因的转基因抗旱性杨树植株[63]。

3转基因杨树耐盐研究

随着全球人口不断增长，工农业污染日益加重，淡水资源急剧减少，土壤盐碱化带来的危害越来越明显，严重制约着我国农林业生产的可持续发展，影响生态环境平衡，阻碍经济发展。因此，提高植物的耐盐性、加强盐碱土的生物治理和综合开发具有重要实际意义。盐胁迫对杨树的生长影响较大，主要影响杨树的生长、光合作用、生物膜、物质代谢和激素的产生等。杨树的耐盐机理主要与渗透调节机制、离子区域化机制与杨树耐盐相关基因（糖醇合成相关基因、甜菜碱合成相关基因以及脱水应答元件DREB类基因）的调节相关[64-66]。

围绕杨树耐盐机理，在抗盐基因工程中主要有以下转化基因进行了应用研究：1-磷酸甘露醇脱氢酶、甜菜碱醛脱氢酶、Na+/H+逆向转运蛋白基因、反义磷脂酶D、6-磷酸山梨醇脱氢酶等。其中Na+/H+逆向转运蛋白和液泡H+焦磷酸化酶是当前植物耐盐研究的焦点，这2种蛋白在植物的抗盐过程中起重要的作用。美国已经获得了转Na+/H+逆向转运蛋白基因的杨树，耐盐效果较好[67]。我国在耐盐转基因杨树的研究取得了良好进展。1-磷酸甘露醇脱氢酶基因、外源基因BetA、山菠菜AhDERB1基因、双价耐盐基因（甘露醇和山梨醇基因）、番茄的ERF类转录因子JERFs基因、mt1D基因[68-74]、辽宁碱蓬的外源基因、NTHK1的转基因、Mn-SOD基因、蒙古柳cDNA农杆菌表达文库、重组质粒pBI121-cAPX、拟南芥Na+/H+逆向转运蛋白（Na+/H+antiporter）基因（AtNHX1）、正义 PLDα基因[75-81]等外源基因成功导入杨树中，并取得了不同程度的耐盐转基因植株。

4转基因杨树在环境修复方面的研究

随着工农业的快速发展，土壤污染日益严重，重金属已成为土壤污染中最严重的污染物之一。采用具有重金属超富集能力的植物对该类土壤进行综合治理是最安全、最经济有效的环境治理方法。但重金属超富集植物生长缓慢、生物量低，而生长速度快、生物量高的林木材料对重金属富集量低。通过基因工程技术在杨树遗传改良上的应用，开展了关于利用杨树修复重金属污染土壤的一系列研究，并取得了一定进展。

1998年，Rugh等将抗重金属相关基因merA转入到杨树中，研究表明，转基因杨树对汞的富集能力是未转基因杨树的10倍，而对重金属汞的耐受性也提高了3～4倍[82]。转基因植株的基因产物也能有选择地影响某些土壤微生物的生长与繁殖，但与施肥、灌水和施药等农作措施相比，影响明显较小[83]。

5存在问题及展望

经过广大研究者的不断努力和探索，利用基因工程技术提高杨树的抗逆性取得了一些成果，但仍存在不足。杨树在分子水平上的定向改造技术远远落后于农作物，杨树的内源优良抗性基因还未被识别和有效利用。能够有效利用于杨树的外源基因多来自于农作物，多数是只能控制单一性状的功能基因，这些基因的转入并不能完全满足杨树多基因调控的要求，现阶段外源基因导入杨树的转化效率低、试验重复性差。如何将外源基因定位整合入杨树基因组中且能在高代转基因材料中稳定表达，挖掘杨树本身优良抗逆基因，实现多基因共转化等方面，还有待进一步深入研究。

利用基因工程技术，对林木进行定向遗传改良提高抗逆性，为培育林木新品种提供了一条新途径。杨树具有生长速度快、生物量高、基因组小等特点，在林木分子遗传育种中有着不可替代的作用。我国的荒地、盐碱地、沙土地、重金属污染地面积大，培育多抗性的速生、丰产、优质杨树品种，为这些地区提供适应的杨树品种，不仅可以改善生态环境，同时也可以促进地方经济的持续发展。

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