部分小麦品种（系）遗传多样性分析及Dx5类似亚基鉴定

胡政　苏明杰　焦浈

摘要：使用SDS-PAGE方法结合分子标记技术，分析了59个有代表性的河南省小麦主栽品种（系）及部分稳定遗传的诱变后代材料的HMW-GS组成及其等位变异。参试材料中共有12种HMW-GS亚基类型，Glu-A1位点上有3种，其中1亚基为主要类型（占57.63%）；Glu-B1位点上共有4种类型，以7+9为主要亚基类型（占67.80%）；Glu-D1位点上有5种亚基组合，其中2+12为主要类型（占52.54%）。59份小麦材料的亚基组合类型共有19种，其中组合为Null、2+12、7+9的样品11份（占18.64%），比例最高；在参试材料中，仅有4个材料检测出优质亚基组合类型（1，7+8，5+10）；此外，从SDS-PAGE电泳图谱上发现有16个材料含有与1Dx5非常近似的亚基（以1Dx5*表示），使用引物Dx*对上述材料进行扩增，均可获得约476 bp的电泳条带，其序列信息与HMW-Dtx2基因、HMW-Dtx5基因相同，与1Dx5′基因编码区相同，与1Dx5基因99%相似。

关键词：小麦；高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）；STS分子标记；Dx5亚基

中图分类号： S512.103.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0024-05

收稿日期：2014-04-08

基金项目：国家自然科学基金（编号：11375154）；河南省基础与前沿技术研究计划（编号：122300410045）。

作者简介：胡政（1988—），男，江西新余人，硕士研究生，主要从事麦类作物遗传育种研究。E-mail：gyzw@hotmail.com。

通信作者：焦浈，教授，主要从事麦类作物遗传育种研究。E-mail：gyzw@hotmail.com。近年来优质成为小麦育种的主攻目标之一[1]，在影响小麦加工品质的各因素中，高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）起着重要作用[2-3]。用于检测HMW-GS最简单有效的方法就是SDS-PAGE电泳，但对于部分电泳条带近似的亚基（如1Bx7和1Bx7OE）仅靠电泳图谱很难区分。目前大量编码 HMW-GS 的基因已被克隆，与其相关的分子标记开发也有很多报道，而分子标记在育种中的应用研究也日趋成熟[4]，且有试验证实，HMW-GS分子标记与其SDS-PAGE检测结果高度一致[5]。因此，将SDS-PAGE与分子标记技术结合应用到HMW-GS鉴定工作中，在保持便捷、快速优势的同时，必将大大提高鉴定的准确性。

小麦Glu-D1位点存在广泛的等位变异，早在20世纪90年代Dovidio等就对硬粒小麦中1Dx2.2+1Dy12、1Dx2.2*+1Dy12、 1Dx2+1Dy12*、 1Dx4+1Dy12等稀有亚基组合进行了分子检测，并验证了其中x型亚基与1Dx5亚基基因的差异[6-7]。近期也不断有新的Glu-D1位点x型亚基被发现。随着与节节麦的杂交，1Dx5+1Dy12、1Dx2.1+1Dy10、1Dx2+1Dy12.2、1Dx2.1+1Dy12.2、1Dx1.5+1Dy10、1Dx2.1+1Dy10.5以及1Dx1.5+1Dy12等亚基组合也不断被引入小麦[8]。

小麦是河南省重要的粮食作物，对小麦高分子量麦谷蛋白亚基的研究多数还停留在20个基础分型上，关于主要的栽培品种和常用的亲本材料是否含有特殊亚基组合鲜有报道。为了进一步了解河南省育种工作者常用种质资源的品质性状，本试验使用SDS-PAGE方法结合分子标记技术，分析了59个有代表性的河南省小麦主栽品种（系）及部分稳定遗传的诱变后代材料的HMW-GS组成及其Glu-D1位点亚基等位变异，从中发掘新的亚基，并为这些材料的进一步利用提供试验依据。

1材料与方法

1.1材料

选用材料共59份，其中33份为河南省主栽品种及育种工作者经常使用的亲本材料（由郑州市农林科学研究所马香花研究员惠赠），26份为笔者实验室保存的使用离子束诱变技术辐照小麦后筛选出的后代稳定的突变体材料（编号为郑大****，“*”表示数字），HMW-GS对照材料（表1）由中国科学院遗传研究所李义文研究员惠赠。

1.2材料蛋白质样品提取

本研究方法根据曹俊梅等的方法[12]改进。

1.3DNA样品提取

使用CTAB法提取小麦幼苗中的DNA[16-17]。

1.4HMW-GS 电泳

采用不连续分离系统进行SDS-PAGE电泳。分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度5%。1×甘氨酸电极缓冲液配方为 0.025 mol/L Tris，0.19 mol/L甘氨酸，0.1% SDS。使用 DYCZ-24DN 型垂直电泳槽（北京六一仪器厂），恒压120 V，电泳4 h。染色液：45%甲醇，10%冰乙酸，0.15%考马斯亮蓝G250。染色2 h，用蒸馏水脱色。使用数码相机拍照，并用camera RAW软件后期调节曝光度、对比度等。参照Payne 等的亚基命名及编号的方法[18]对亚基进行记录。

1.5分子标记检测

1.6数据分析

HMW-GS参照Payne等的方法[18，20]进行编号以及品质评分。

2结果与分析

2.1供试小麦材料的HMW-GS 等位变异

以对照材料（表1）SDS-PAGE电泳谱带为标准，对59 份小麦材料的HMW-GS进行分析，结果（表2）表明，59份供试材料中共检测到12 种HMW-GS 类型。Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点上的等位变异分别为3、4、5种。Glu-A1位点的3种等位变异中1亚基比例最大，达到59.32%。Glu-B1位点上的4种等位变异中，7+9亚基出现的频率最高，达到6780%。Glu-D1位点是3个位点中等位亚基组合变异最为丰富的，且 2+12 亚基出现频率最高，为50.85%。此外，有2份材料同时含有1Dx2、1Dx5*亚基。表259 个小麦材料的HMW-GS组成

品种

2.2供试小麦材料HMW-GS的组合类型

由表3、表4可知，59份小麦材料中，Glu-1位点共检测到19种亚基组合，类型较多。其中null/7+9/2+12组合的材料有11份，出现频率为18.64%；其次是1/7+9/2+12组合，出现频率为16.95%；其余亚基组合出现的频率都低于10%。由于某些亚基的品质评分标准尚未确定，20种亚基组合中只有6种得到评分结果，评分值介于5～10分之间。1/7+8/5+10亚基组合的评分值最高，但其频率仅有678%；相反，null/7+9/2+12组合出现的频率最高，但其评分值仅为5分。

2.3使用分子标记鉴定 Dx5近似亚基Dx5*

通过SDS-PAGE电泳发现，有16个材料[郑大0601、L799、郑大0605、周麦28、周麦27、郑大0741、郑大0942、郑大0643、郑大0747、中国农大9D483s2199、偃展99（98）、温6、郑麦883、偃展988-3-2、郑大0912、郑大0817]Glu-D1x型HMW-GS的电泳速率都快于1Dx5亚基（部分材料的电泳图谱见图1），而且与其连锁的Glu-D1位点y型HMW-GS也并非1Dy10亚基，而是1Dy12亚基。

使用Dx5分子标记引物对上述16份材料进行PCR扩增，电泳检测均表现为阴性（部分材料分子标记扩增图谱见图2）。根据NCBI已有 Glu-D1位点x型亚基的序列多态性，设计引物Dx*再次对以上材料进行PCR扩增，均可获得约476 bp的电泳条带。对PCR扩增产物回收测序并进行BLAST分析发现（图3），其序列信息与Aegilops tauschii HMW-Dtx2等位基因[21]、Triticum aestivum 株系SQ-884、SQ-188、SQ-783、SQ-180、SQ-659高分子量麦谷蛋白亚基Dtx5等位基因[22]相似程度为100%，与小麦1Dx5亚基对应基因相似程度为99%，与1Dx5′ 编码区[23]相似度100%。

3结论与讨论

许多研究证明，在育种早代选择中，根据HMW-GS与品质相关性的大小，选择与优质有关的亚基作为优良的标志和育种目标是可行的[24-28]。本试验结果表明，检测的59份小麦材料HMW-GS 的变异和组合类型均比较丰富，在Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点上共检测到12种亚基和20 种亚基组成，其中有35个含有1亚基，3个含2*亚基，13个含7+8亚基，5个含14+15亚基，7个含5+10亚基，这些材料可供优质小麦育种利用。与前人研究结果相比，参试的59份材料在Glu-A1位点编码的与优质有关的1Ax1和1Ax2*亚基的比率（64.41%）高于国内育成品种（10.78%～42.6%）平均水平，Glu-B1位点上的7+8优质亚基（22.03%） 在国内育成品种（36.1%～65.96%）中属于较低水平，在Glu-D1位点上5+10亚基比例（11.86%）在国内育成品种（9.30%～3636%）中属于较低水平， 表明河南省小麦育种比较重视品

质的改良，拥有一批性状优良、品质较优的资源[12，29-33]。但在这些资源中，优质亚基组合类型较少，“1Ax1、Bx7+By8、1Dx5+1Dy10”评分最高的组合所占比率仅为6.78%，因此在河南省小麦品质育种中，应注重利用含有不同位点优质亚基的亲本材料配制杂交组合，使不同的优质亚基能充分聚合到同一材料中，从而选育出优质亚基聚合体，改良小麦的亚基组成，提高小麦品质。

SDS-PAGE电泳技术是分析鉴定小麦HMW-GS最简单快速的方法。但是如果得到的电泳谱带与对照样品有细小差异、难以判定时，使用分子标记技术辅助鉴定最为有效、快捷。本研究利用这一方法成功区分1Dx5*亚基，经比对发现其序列信息与小麦近似种的HMW-Dtx2等位基因一致，这在以往对河南省小麦材料的研究中未见报道。以往认为小麦HMW-GS高度保守，然而近期Glu-D1d位点不断有新的等位基因被发现[8，21-23]。最近有报道推测，10 000年前，小麦Glu-D1d位点起源自不同的供体，因此小麦Glu-D1d位点还是存在着不同的等位基因变异[34]。本研究分析的河南省目前广泛使用的部分小麦材料中大量存在着与1Dx5亚基SDS-PAGE电泳谱带相似，过去被认为是1Dx5亚基（如温6）的储藏蛋白，这类亚基的品质特性尚未得到鉴定。对它的鉴定与品质研究或许可以为今后的小麦品质育种工作作出一定贡献。

在对NCBI已登记的所有Glu-D1位点x型亚基DNA序列进行比对后，发现编码区第353位仅存在G（同1Dx5亚基）、C（同1Dx2亚基）2种变异。使用中国春全基因组为模板，Dx*引物也可通过错配扩增得到约476 bp条带；而使用纯水作为对照，Dx*引物无法得到扩增产物。因此，在使用分子标辅助鉴定小麦1Dx5亚基时，本研究使用的Dx*引物可以作为Dx5分子标记的对照使用，在Dx5分子标记扩增条带为null时，使用Dx*引物对其进行扩增，如果可以得到约476 bp条带，则可断定样品Dx5分子标记扩增为阴性。通过这个方法可以排除Dx5分子标记PCR检测中可能出现的假阴性，从而提高分子标记辅助鉴定1Dx5亚基的准确性。

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