木薯胚性愈伤组织诱导及其离体保存的研究

黎萍　黄秋伟　彭靖茹　石兰蓉　李慧敏

摘要：以4个不同木薯品种（SC205、GR3、GR891、GR911）的无菌苗幼叶或带有腋芽的茎段为试验材料，研究不同植物生长调节剂浓度及组合对其胚性愈伤组织诱导的影响，并对其离体保存条件进行了研究。结果表明：2，4-D和毒莠定对4个不同木薯品种的幼叶及腋芽均能诱导出胚性愈伤，诱导能力为GR3最高，其次为SC205。4个品种以幼叶或腋芽为试料，在毒莠定或2，4-D为12 mg/L时（除GR911幼叶、GR891腋芽），诱导效果最佳；相同木薯品种在不同激素组合的诱导条件下，IBA+6-BA浓度为（1.5+0.8）mg/L组合诱导胚性愈伤分化数量多于单独使用IBA、6-BA，表现出一定的显著差异性。在20 ℃条件下，将GR3木薯胚性愈伤组织保存在添加比久（B9）或烯效唑浓度为 6 mg/L 的保存培养基（含 12 mg/L 毒莠定+30 g/L蔗糖+6.5 g/L脂琼的GD培养基，pH值5.8）中，保存效果最佳，继代时间延长至80 d。

关键词：木薯；胚性愈伤；离体保存；蔗糖；B9；烯效唑；细胞活力

中图分类号： Q943.1；S533.043文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0048-04

收稿日期：2014-05-29

基金项目：广西壮族自治区自然科学基金（编号：2012GXNSFAA053072）。

作者简介：黎萍（1966—），女，广西博白人，农艺师，主要从事植物组织培养与快速繁殖研究。Tel：（0771）2539097；E-mail：lipinggx1026@163.com。木薯（Cassava）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯属（Manihot）的灌木状植物，是世界3大薯类作物之一[1]，在我国广为栽培，主要栽培于热带和亚热带地区。木薯的栽培及加工利用在农业生产中占有重要的地位，目前世界各木薯生产国收集保存的木薯种质已有8 500多份[2]，国内主要采用种质资源圃的形式对木薯种质资源进行保存，这种保存方式需要大量的土地和人力资源，成本高，保存数量有限，且易遭受各种自然灾害的侵袭[3]。离体保存技术的迅速发展[4]，为长期有效地保存木薯种质资源提供了新的有价值的手段，由于其具有省时、省地、省空间和无病虫害侵害等优点，目前正广泛用于生产实践的各个领域。有关木薯胚性愈伤组织离体保存的研究较少，因此，笔者以广西壮族自治区亚热带作物研究所提供的木薯品种为试验材料，进行了木薯胚性愈伤组织诱导及其离体保存的研究，以期为木薯种质资源的长期离体保存提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试品种供试木薯品种SC205、GR891、GR911、GR3均由广西木薯研究所、广西亚热带作物研究所提供。

1.1.2试验仪器主要仪器有电子分析天平、超净工作台、高压灭菌锅、紫外可见分光光度计、电热恒温培养箱、循环水真空泵。

1.1.3试剂甲醇、保险粉（Na2S2O4）、氧化三苯基四氮唑（TTC）粉、石英砂、蔗糖、琼脂、2，4-D、6-BA、IBA、毒莠定、B9、烯效唑等。

1.2试验方法

1.2.1诱导改良分化培养基配制M1培养基：MS+2 mol/L CuSO4+2%蔗糖+0.3%琼脂，pH值6.0；M2培养基：M1+12.0 mg/L 6-BA；M3培养基：M1+毒莠定或2，4-D；M4培养基：M1+6-BA/IBA，或M1+6-BA+IBA。

1.2.2无菌外植体获取取上述4个不同木薯品种无菌苗茎切段在M1培养基上继代培养扩繁，获得大量无菌苗备用。

1.2.3腋芽及幼叶的膨大诱导取在M1培养基上培养4周的无菌苗，切取1.0～1.5 cm带腋芽的茎段或者幼叶，将其水平放置在M2培养基上，30个/皿，培养温度26 ℃，每天光照16 h（800～1 000 lx），膨大培养3～7 d，观察记录。

1.2.4胚性愈伤组织的诱导2，4-D及毒莠定是2种最常用的诱导胚性愈伤的激素，优化激素浓度组合研究中设定2，4-D及毒莠定的浓度梯度均为6、12、14、18 mg/L。在M1中分别添加不同浓度的2，4-D或毒莠定，即为诱导培养基M3。挑取已膨大的芽点（约1 mm）或者从茎尖挑取1～2 mm幼叶，转移到M3培养基，30个/皿，5皿/处理，26 ℃暗培养。每2 d在体视显微镜下观察胚性愈伤的发生情况，第4天开始记录，统计外植体形成初生胚的数目，计算出胚率。当球形或鱼雷形胚出现，则将其转移、继代到新鲜M3培养基上备用。

1.2.5体细胞胚的继代、成熟将M3培养基上诱导获得的初生胚状体从培养块分离、转移到新鲜的M4上继代培养，诱导次生胚状体发生和增殖，2周继代1次，建立循环培养；观察、统计增殖速率。

1.2.6胚性愈伤组织保存条件的筛选方法选择由品种GR3腋芽诱导出的颗粒状胚性愈伤组织，在显微镜下用针头挑出较纯化的胚性愈伤，以含有12 mg/L毒莠定、30 g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂的GD培养基（pH值5.8）为常规保存培养基，每20 d继代1次，培养条件为温度25 ℃，光照度800～1 000 lx，光照时间12 h/d。

1.2.7离体保存试验方法

1.2.7.1不同浓度蔗糖处理对木薯胚性愈伤保存的影响将愈伤组织接种在分别附加10、20、30、40、50 g/L蔗糖的GD+12 mg/L 毒莠定+6.5 g/L琼脂固体培养基中，以添加 25 g/L蔗糖的培养基为对照。

1.2.7.2生长抑制剂处理对木薯胚性愈伤保存的影响将待保存的愈伤组织接种在分别附加2、4、6、8、10 mg/L的B9、烯效唑（S3307）的GD+12 mg/L 毒莠定+6.5 g/L脂琼+25 g/L 蔗糖固体培养基中，以不附加抑制剂为对照。

不同浓度蔗糖浓度和生长抑制剂处理的愈伤组织均放置在培养温度20 ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照时间12 h/d的条件下，第1次于培养20 d观察，以后每15 d观察1次，测定其生长量和细胞活力。

1.2.7.3不同温度处理对木薯胚性愈伤保存的影响将正常保存接种后的材料分别于0、10、15、20、26 ℃下保存，以 26 ℃ 下正常培养的材料为对照，光照时间和测定内容与上述方法相同。

1.2.7.4细胞活力测定方法木薯胚性愈伤细胞活力的TTC法测定参照白宝璋的方法[5]并略有改动。主要步骤如下：（1） 取0.25 mL 0.4% TTC溶液，加9.75 mL乙酸乙酯和少量保险粉于10 mL容量瓶中，充分摇动，以所生成的红色TTF溶液作为已知母液，取5支10 mL容量瓶，按照表l所给数据配制系列浓度溶液，并用甲醇定容。用紫外分光光度计比色，以甲醇作空白对照，检测波长485 nm，记录D485 nm值。并以D485 nm值为纵坐标、以TTF的含量为横坐标，绘制出以甲醇为溶剂的标准曲线，详见图1。

（3）将胚性愈伤取出，用循环水真空泵滤干水分，再用滤纸压干愈伤水分，放入试管中，加入5 mL甲醇溶液，然后将试管置于35 ℃保温箱3 h，使愈伤组织完全变白。将红色提取液移入容量瓶，最后加甲醇，使总量为10 mL，用分光光度计在波长485 nm下比色，以空白对照试验作参比测出吸光度D485 nm，查标准曲线，求出TTC还原量。

（4）结果计算：愈伤组织活力值[mg/（g·h）]=TTC还原量（μg）/[愈伤组织质量（g）×时间（h）]；生长量（g）=愈伤组织的终质量（g）-愈伤组织接种质量（g）。

2结果与分析

2.12种植物生长调节剂对诱导幼叶愈伤组织的影响

表2试验结果表明，2，4-D和毒莠定对4个木薯品种的幼叶均能诱导胚性愈伤。运用DPS v7.05软件LSD法分析可知，不同木薯品种在相同的诱导条件下，GR3的幼叶诱导胚性愈伤的平均数量多于SC205、GR891、GR911，说明GR3的幼叶诱导能力最高，其次为SC205，GR891、GR911的诱导能力较差；相同木薯品种在不同激素水平诱导条件下，2，4-D浓度为12、14 mg/L时，除GR911、GR891外，幼叶诱导胚性愈伤的数量均高于浓度为6、18 mg/L；毒莠定浓度为12、14 mg/L时，幼叶诱导胚性愈伤的数量高于浓度为6、18 mg/L，而且差异显著。4个品种中，除GR911在2，4-D为14 mg/L时诱导效果好于12 mg/L外，其余3个品种均在2，4-D为 12 mg/L 时诱导效果最好。综合2种生长调节剂在不同浓度下的诱导愈伤效果来看，以幼叶为材料，4个品种均在毒莠定为12 mg/L时的诱导效果表现较好，木薯品种间的基因型对诱导胚性愈伤的能力表现出明显差异。表22，4-D及毒莠定对4个木薯品种幼叶诱导胚性愈伤的影响激素种类浓度

2.22种植物生长调节剂对腋芽诱导愈伤组织的影响

表3试验结果表明，2，4-D和毒莠定对4种木薯栽培品种的腋芽均能诱导出胚性愈伤。运用DPS v7.05软件LSD法分析可知，不同木薯品种在相同的诱导条件下，GR3、SC205的腋芽诱导胚性愈伤的数量多于GR891、GR911，与幼叶诱导效果一致。2，4-D和毒莠定在12、14 mg/L 浓度下对4个品种的诱导效果均明显好于6、18 mg/L，且4个品种均在毒莠定、2，4-D为12 mg/L时诱导效果最好（除GR891）。综合2种生长调节剂不同浓度的表现来看，以腋芽为材料，品种间诱导胚性愈伤的能力有较大差异，大致可以分为2组，即GR3、SC205为1组，GR891、GR911为1组，且前1组的诱导效果要明显好于后1组。表32，4-D及毒莠定对4个木薯品种腋芽诱导胚性愈伤的影响

2.3植物生长调节剂组合对诱导愈伤组织分化的影响

运用DPS 7.05软件LSD法对表4试验结果进行分析可知，除GR891，相同木薯品种在不同激素组合的诱导条件下，IBA+6-BA诱导胚性愈伤分化数量多于IBA、6-BA，且存在显著差异；而IBA、6-BA间的差异性不明显，诱导效果优越性排序为 IBA+6-BA>IBA>6-BA。除GR911，相同木薯品种在不同激素水平诱导条件下，IBA浓度为1.5、2.0 mg/L时，诱导胚性愈伤分化数量的数量多于1.0 mg/L，表现显著差异；相同木薯品种在不同激素水平诱导条件下，6-BA浓度为08 mg/L时，诱导胚性愈伤分化数量多于0.4、1.2 mg/L，表现显著差异；相同木薯品种在不同激素水平诱导条件下，IBA+6-BA 浓度为（1.5+0.8） mg/L诱导胚性愈伤分化数量多于（1.5+0.4）、（1.0+0.4） mg/L，差异明显或显著。

IBA、6-BA单独使用均能使木薯4个品种的胚性愈伤发生不同程度的分化，但二者的组合均比单独使用时效果明显提高，说明二者之间具有一定程度的协同作用。1.5 mg/L IBA+0.8 mg/L 6-BA 的组合诱导4种木薯品种胚性愈伤的分化效果最好。从品种间整体愈伤诱导差异来看，GR3略优于SC205，但均明显优于GR911，整体愈伤诱导最差的是GR891，说明不同品种间的差异还是比较明显的。

2.4不同处理对木薯胚性愈伤保存的生长量及细胞活力的影响

从表5可见，随着保存时间的延长，各处理组及对照组均表现出生长量增加、细胞活力下降的趋势，但生长量和细胞活力下降幅度各异，其中生长抑制剂B9、烯效唑浓度均在6 mg/L时表现效果最佳。

在蔗糖浓度低于30 g/L时，随着蔗糖浓度升高，木薯愈伤组织的周期增殖量总体看来也在增大，添加30 g/L蔗糖的处理，20 d增殖量达到2.04 g，细胞活力值达0.545 mg/（g·h），细胞活力高于对照；而后随着蔗糖浓度继续升高，愈伤组织增殖量反而有所下降，因为愈伤组织不能进行光合作用，完全处于一种异养状态，当培养基中的碳源供应不足时，组织长期处于碳饥饿状态，生长受阻；当蔗糖浓度继续提高时，培养基渗透压增加，超出一定浓度，愈伤组织吸收水和养分受阻，抑制了生长[6]。

B9能够提高培养基的渗透压，从而抑制材料的生长，因此常作为生长调节物用于缓慢生长保存，本试验用B9保存也得到了较好的结果，添加6、8 mg/LB9，经过50 d保存后，愈伤组织生长量分别达到2.87、2.45 g，细胞活力分别达到0426、0.311 mg/（g·h），细胞活力明显高于对照；随着B9浓度继续升高，添加10 mg/L B9，对愈伤组织的生长及细胞活力影响明显，严重抑制材料的增殖，并影响到其活力，因此，添加6 mg/L B9有利于提高木薯胚性愈伤组织生长量和细胞活力。

对木薯胚性愈伤组织的保存作用也有影响，效果与B9差异不明显，说明这2种生长抑制剂均能延缓木薯胚性愈伤保存时间。在培养基中添加6 mg/L烯效唑，保存35 d，愈伤组织生长量为2.36 g，稍低于对照（2.69 g），但细胞活力保持在0.471 mg/（g·h），高于同期对照组的细胞活力。烯效唑浓度提高至10 mg/L 时，仅保存20 d，愈伤组织的细胞活力就下降至0.318 mg/（g·h），稍低于对照，由于愈伤组织的存活受到抑制，因此，添加高浓度的烯效唑不利于愈伤组织的保存。

在木薯愈伤组织保存过程中，温度具有重要作用。当温度处于0～10 ℃时，愈伤组织几乎无法存活，即使转入常温也无法生长。继代20 d后，TTC法测其活力，其活力值很低，仅为0.156 mg/（g·h）（温度10 ℃），生长量仅为0.54 g，几乎没有增殖；在15、20 ℃条件下，虽然愈伤组织生长量增殖不大，但保存50d时，20、26 ℃（对照）处理愈伤组织活力差异很明显，分别为0.298、0.101 mg/（g·h），保存65 d时，26 ℃处理几乎没有细胞能力，20 ℃处理活力仍高，说明20 ℃有利于木薯愈伤组织保存，常温保存时，在短时间内愈伤组织增殖量大，衰老很快，而低温可以延缓衰老，并降低短时间内的增殖量。

3结论与讨论

在植物组培中，植物生长调节剂是影响愈伤组织诱导的重要因素，植物生长调节剂的种类、浓度以及它们之间的组合影响着愈伤组织的诱导和分化[7]，合适的细胞分裂素和生长素的组合，能促进愈伤组织的形成及分化。何亚文等将木薯NZ188无菌苗茎段接种在MS附加IBA、BA固体培养基上，能诱导出愈伤组织[8]；覃艳等用不同浓度2，4-D和6-BA组合能从木薯腋芽诱导出愈伤组织[9]。席世丽等用不同浓度6-BA和NAA组合能从木薯花药诱导出愈伤组织[10]。本试验比较了单独使用2，4-D、毒莠定、IBA、6-BA及IBA+6-BA组合生长调节剂对4个不同木薯品种愈伤组织诱导的效果，结果显示，使用2，4-D、毒莠定浓度为12 mg/L时能从幼叶或腋芽诱导出木薯胚性愈伤组织且效果最好，1.5 mg/L IBA+0.8 mg/L 6-BA的组合诱导4种木薯品种胚性愈伤的分化效果最好，能够将水浸状愈伤组织继续分化成浅绿色颗粒状愈伤组织，且品种间差异较明显。

由表2、表3、表4的结果可以看出，取不同品种的无菌苗幼叶及腋芽为接种材料，在相同的培养基上诱导愈伤组织的差异较大，这种差异反映了不同基因型对相同生长调节剂或组合的反应不同，而且在本试验中也反映了同一基因型对不同的生长调节剂或组合的反应也不同，这可能由材料本身的内源激素造成的。而组合1.5 mg/L IBA+0.8 mg/L 6-BA 中的激素配比可能与多数品种的内源激素之间产生协调关系，因此这个处理对多数品种愈伤组织的分化最适合。

离体保存成功的关键因素之一是使用合适的植物生长抑制剂[11]。在种质资源离体保存过程中，缓慢生长法是通过调节培养温度和改变培养基成分来抑制保存材料的生长和延缓材料衰老从而延长继代时间的1种保存方法[12]。本研究中，经单因素试验比较，得出在20 ℃条件下在常规培养基（含 2 mg/L 毒莠定+30 g/L蔗糖+6.5 g/L脂琼的GD培养基，pH值5.8）中添加6 mg/L B9或烯效唑的方法，可将木薯品种GR3胚性愈伤组织的继代时间延长至80 d，且继代细胞活力率较高，可作为木薯胚性愈伤离体保存方法之一。

从试验结果可以发现，适当低温培养有利于提高木薯胚性愈伤组织的细胞活力。常规保存（26 ℃）下，培养65 d的木薯胚性愈伤组织完全失活，愈伤老化，呈褐色颗粒状，而生长量增多；随着培养温度的降低，愈伤组织细胞活力增强，适合离体保存方法。该结论与洪森荣等报道降低培养温度是植物组织培养缓慢生长保存最常用的方法[13]一致 本试验得出，

温度在20 ℃时最适合木薯胚性愈伤组织保存的结论。蔗糖是影响木薯胚性愈伤组织生长的关键因素，提高蔗糖浓度可增加培养基的渗透压，使愈伤组织对水分和养分的吸收受阻，从而延缓离体保存材料的生长速度，但在保存后期却能加剧愈伤组织的褐变，不利于愈伤组织稳定保存，因此在保存过程中不宜采用增加蔗糖浓度的方法。本试验结果表明，蔗糖浓度在30 g/L时有利于木薯胚性愈伤组织的保存。

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