广藿香根际土壤微生物总DNA提取方法的优化

徐岩　吴友根　张军锋　杨东梅　胡新文

摘要：提取高质量的土壤微生物DNA是进行后续分子生物学试验的前提。在3种常用土壤微生物DNA提取方法的基础上，提出了1种新的优化方案，包括使用添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的磷酸缓冲液对土壤进行预洗、联合使用SDS-CTAB和蛋白酶K来破碎细胞、用酚-氯仿-异戊醇（25 ∶24 ∶1）除蛋白质和淀粉等杂质、使用PEG8000沉淀DNA、用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化DNA等。比较分析了优化的方法与其他3种常用方法所获得的总DNA产率和纯度的差别，结果表明，优化的方法所提取DNA的D260 nm/D230 nm、D260 nm/D280 nm值均高于其他3种方法，且PCR扩增条带清晰、DNA产率高，土壤中DNA得率达88.76 μg/g，表明该方法适宜提取土壤中的微生物DNA，从而为研究广藿香根际土壤微生物种类及其多样性奠定了基础。

关键词：广藿香；总DNA；根际土壤；微生物；提取方法

中图分类号： S154.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0045-03

收稿日期：2014-04-08

基金项目：国家自然科学基金（编号：31360210）；海南省中药现代化专项资金（编号：2012ZY015）。

作者简介：徐岩（1988—），女，吉林白山人，硕士研究生，研究方向为南药种质资源与活性成分。E-mail：490329151@qq.com。

通信作者：张军锋，硕士，副教授，研究方向为南药种质资源与活性成分。E-mail：zhangjunfengvip@qq.com。广藿香[Pogostemon cablin （Blanco） Benth.]为唇形科刺蕊草属植物，原产于东南亚地区，如马来西亚、菲律宾、印度尼西亚等国，在我国引种可追溯到梁代或以前[1]，我国的主要栽培地为海南、广东两省。广藿香以其干燥地上部分入药，是我国常用的芳香化湿类中药之一，常用于治疗湿浊中阻、脘痞呕吐、暑湿倦怠、胸闷不舒、寒湿闭暑、腹痛吐泻、鼻渊头痛等[2]。广藿香不仅是30多种中成药的主要原料，而且从其中提取的广藿香油还是医药和轻化工业的重要原料[3]。然而，广藿香在种植过程中连作障碍十分明显，通常认为根系分泌物会破坏土壤微环境、改变土壤微生物群落结构及多样性，从而影响植物自身生长[4-5]。因此，研究广藿香土壤微生物的区系状况和变化是解决广藿香连作障碍的重要环节。传统的分离鉴定法可培养土壤微生物的数量仅占总微生物数量的0.1%～1.0%[6]，不能全面地反映根际土壤微生物的区系状况，局限性十分明显。目前，通过基于土壤微生物群落总DNA的现代微生物分子生态学方法研究土壤中微生物，能较全面获得土壤微生物种类与多样性的信息。此方法作为微生物群落分子分析方法的基础，最重要的一步就是从土壤样品中尽量毫无偏差地提取出高质量的微生物总基因组DNA。迄今尚未见关于广藿香根际土壤微生物总DNA提取的报道，本研究采用4种方法对广藿香根际土壤微生物总DNA进行提取和优化，旨在为克服广藿香种植中连作障碍及其根际土壤微生物区系的研究提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试土壤样品于2013年9月取于海南省万宁市广藿香种植园内，取样面积为100 m2（10 m×10 m），采用5点混合采样法，根际土壤采集按慕东艳等的方法[7]进行。将取好的土壤混匀，除去明显杂质后装入无菌袋中，过80目筛后于-80 ℃冰箱保存待用，供试土壤的部分理化性质：土壤为沙壤土，pH值593%，全氮含量（0.998±0.001）g/kg，全钾含量（2.172±0.025）g/kg，全磷含量（0.623±0.009）g/kg，含水量30.2%。1.2广藿香根际土壤微生物总DNA的提取方法

1.2.1方法1改良CTAB法：在Ellingse等方法[8]的基础上，将CTAB浓度提高到3%，并增加“SDS裂解前，37 ℃水浴及涡旋振荡”的步骤。

1.2.2方法2聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVP）法：参照Jia等的方法[9]进行。

1.2.3方法3超声细胞破碎法：称取0.5 g根际土壤，加入1.5 mL DNA提取缓冲液[100 mmol/L Tris-HCl（pH值80），100 mmol/L EDTA （pH值8.0），100 mmol/L磷酸钠（pH值8.0），1.5 mol/L NaCl，1% CTAB]，置于超声细胞破碎仪内，超声振荡30 min后，于室温、8 000 r/min离心 10 min，收集上清并转移到2 mL离心管中，用0.6倍体积的异丙醇沉淀DNA；于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，收集核酸沉淀，用4 ℃ 70%乙醇洗涤沉淀后重悬于灭菌的去离子水中，最终体积为100 μL。

1.2.4方法4采用笔者优化的方法：在张瑞福等方法[10]的基础上优化，即（1）土壤预洗：取0.5 g土壤样品，加入 10 mL 2%磷酸缓冲液[pH值8.0，含2% 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）]，磁力搅拌15 min，于10 000 r/min离心5 min，取沉淀，重复上述步骤洗涤2次，将沉淀转移至1.5 mL离心管中，于-20 ℃冰箱保存备用；（2）DNA提取：称取0.5 g根际土壤，加入1.5 mL DNA提取缓冲液（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L磷酸钠，1.5 mol/L NaCl，2% CTAB），再加入10 μL蛋白酶K，37 ℃水浴30 min，其间每 10 min 用涡旋仪振荡1次，接着加入150 μL 20% SDS，65 ℃水浴3 h，每隔15～20 min摇晃1次，于室温、8 000 r/min离心10 min，收集上清并转移到2 mL离心管中。用等体积的酚-氯仿-异戊醇（25 ∶24 ∶1）抽提。离心后将水相转移至已灭菌的2 mL离心管中，用1/3体积的PEG8000于-20 ℃沉淀2 h，4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，收集核酸沉淀，用4 ℃ 70%乙醇洗涤沉淀，重悬于灭菌的去离子水中，最终体积为100 μL。

1.3广藿香根际土壤微生物总DNA的纯化方法

参照UNIQ-10柱式DNA凝胶回收纯化试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]的步骤进行回收纯化。

1.4广藿香根际土壤微生物总DNA粗提物及纯化物的产率及纯度检测

用分光光度法分别测定D260 nm、D280 nm、D230 nm值，计算其比值D260 nm/D230 nm、D260 nm/D280 nm。

1.5广藿香根际土壤细菌16S rDNA的PCR扩增条件

采用细菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，907R：5′-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3′扩增16S rDNA片段。其中正向引物的5′端用带羟基荧光素（FAM）的荧光标记。扩增采用4管平行，20 μL反应体系为：10 μL 2×PCR Mix，各 2 μL 引物（1 μmol/L），1.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U），2 μL牛血清蛋白（BSA）（2 μg/μL），1 μL模板，3.5 μL 无菌水。反应条件为：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

2结果与分析

2.1土壤微生物DNA提取方法的分析

2.1.1DNA纯度D260 nm/D280 nm主要用来检测蛋白质和酚类物质的污染情况，而D260 nm/D230 nm主要用来检测糖类、盐类或有机物等杂质的污染情况。从表1可见，方法3所得DNA样品的D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm均低于其他3种方法，而方法4所得的DNA纯度最高，D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm分别为1.75、1.83。

2.1.2DNA产率由表1可见，方法4提取的DNA产率最高，达 88.76 μg/g，可能是因为增加了土壤预洗过程，使得杂质减少，且使用了1/3体积的PEG8000沉淀DNA，沉淀效果好，从而增加了DNA的产率。方法3所得的DNA产率最少，仅为1.67 μg/g。结果表明，在不添加化学裂解液的情况下，物理方法可能使细胞破壁不完全，导致DNA产率降低。

表14种方法提取广藿香根际土壤样品的DNA纯度与产率分析

方法编号D260 nm/D230 nmD260 nm/D280 nmDNA产率

（μg/g）11.01±0.06A1.35±0.02A3.36±0.14A21.54±0.01B1.54±0.09B58.13±0.85B30.86±0.06C1.16±0.02C1.67±0.09C41.83±0.01D1.75±0.04D88.76±1.32D注：D260 nm/D280 nm比值在1.8～2.0之间表明较纯；D260 nm/D230 nm>2.0较好。

2.2广藿香根际土壤微生物总DNA的提取和检测

将4种方法所提取的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，从图1可以看出，4种方法均可提取广藿香根际土壤微生物总DNA，其中方法2、方法4所得的DNA浓度远高于方法1、方法3。试验中还发现，除方法4外，其他方法提取出的DNA均呈现不同程度的棕褐色，说明土壤预洗可有效地去除土壤中的杂质。

2.3广藿香根际土壤微生物的PCR扩增结果

以所提土壤DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行扩增。由图2可见，方法3提取的DNA样品扩增条带均不清晰；方法1、方法2提取的DNA有50%的扩增条带不清晰；方法4所得的DNA均能扩增出目标条带且效果最好，可

直接用于后续分析。

3结论与讨论

一般认为，药用植物在栽培中产生的连作障碍，与根际土壤中的微生物群落变化密切相关，根际土壤中的微生物可以促进植物的生长发育，同时对植物体其他生命活动进行调控[11-13]。基于土壤微生物群落总DNA的现代微生物分子生态学方法研究土壤中微生物，能较全面获得土壤微生物种类与多样性的信息。然而，此方法最重要的一步就是提取高质量的微生物总基因组DNA。由于广藿香根际土壤成分复杂，如腐殖酸、重金属离子、大分子杂质等，因此需要筛选和优化土壤微生物总DNA的提取方法。本研究筛选和优化了4种

广藿香根际土壤微生物总DNA的提取方法。方法1仅用CTAB作为裂解液，微生物细胞裂解不完全，DNA产率及纯度低，杂质多，后续的PCR扩增效果不理想；方法2尽管有SDS和PVP 2种裂解液，其提取的DNA浓度、纯度和产率均略高于方法1，但也不是最佳的方法；方法3采用超声细胞破碎法，未添加化学裂解液，不能完全破碎细胞壁，DNA不能全部从细胞中释放出来，导致产率低，且不能去除土壤样品中的杂质；方法4采用CTAB和SDS2种裂解液，提取效果较好，加上与蛋白酶K及PVP的共同作用，可更好地结合土壤中的腐殖酸，防止大片段的DNA降解，从而得到更纯的土壤微生物DNA。试验中还发现，方法4中的聚乙二醇（PEG）沉淀DNA的效果较好，使所得DNA纯度较高，且不影响其产率。当前，土壤微生物DNA有时采用专一试剂盒来提取，虽然操作简便，但是价格昂贵[14]。方法4所提取的DNA纯度和产率高，PCR扩增的条带清晰，提取的DNA可用于根际土壤微生物群落和多样性分析，表明方法4适宜提取土壤中微生物总DNA，此方法为广藿香种植中克服连作障碍及其根际土壤微生物区系的研究提供了科学依据。

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