貂源绿脓杆菌的分离鉴定及其生物学特性研究

许 皓，刘建荣，倪 佳，任 飞，王力欣，王 峥，刘 莹

吉林特研生物技术有限责任公司,吉林长春 130122

绿脓杆菌是能够引起急性、高度传染性疾病的、可以导致水貂出血性肺炎的一种细菌。本菌革兰氏染色呈阴性，单个、成双或短链状存在，能单向运动，无芽孢，能形成荚膜，能分泌绿脓菌素和荧光素。采用日本血清分型系统将绿脓杆菌分为A～N 14种血清型。近年来，我国山东省、河北省、黑龙江省、吉林省等地主要的水貂养殖地区持续暴发流行水貂出血性肺炎，对水貂的致病力往往是致死性的，造成水貂严重的出血性肺炎，给养殖户带来了巨大的经济损失。本研究对2013～2016年不同省份病料的采集，进行了细菌分离鉴定和相关实验，结果表明绿脓杆菌G、B、I是最流行的血清型，是导致养殖场水貂大规模死亡的原因。

1 材料

1.1 菌株

绿脓杆菌标准菌株ATCC27853为杭州天和微生物试剂有限责任公司的产品。

1.2 试验动物

18～20日龄SPF级ICR小鼠，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。

1.3 主要试剂

绿脓杆菌分型血清为日本生研株式会社的产品；琼脂（Agar）均为Sigma-Aldrich公司的产品；蛋白胨、酵母粉均为英国OXOID公司的产品；NaCl为广东光华科技股份有限公司的产品；PCR反应预混液Ex Taq™ 为生工生物工程（上海）股份有限公司的产品；生化鉴定管、药敏片为杭州滨河微生物试剂有限公司的产品。

1.4 主要仪器

超净工作台（SW.CJ.2FD）购自上海博迅实业有限公司医疗设备公司；空气恒温摇床（KYC111）购自上海福玛实验设备有限公司；PCR仪（T100TM Thermal Cycler）购自伯乐生命医学产品有限公司；电热恒温水槽（DK-8D）购自上海精宏实验设备有限公司；隔水式培养箱（BG-160）购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；光学正置显微镜（Axio Lab. A1）购自卡尔蔡司公司。

2 方法

2.1 病料采集与细菌分离

423 份病料样品来自2013～2016年山东省、河北省、黑龙江省、吉林省的82个水貂群，包括大、中、小型养殖场和各种类型的农村散养户。发病水貂多表现为呼吸困难、鼻孔流血、突发性死亡等症状。采集患病水貂肺组织，用无菌剪刀在肺组织剪开一个切口，将接种环深入切口内取样，划线接种于PYG平板，37 ℃培养18～24 h后观察，挑取各种优势菌落传代纯化。

2.2 细菌培养

将采集的肺脏病料组织划线接种于PYG平板上，37 ℃培养18～24 h后挑取疑似菌落进行传代纯化，再培养18～24 h后观察菌落形态。同时，分别挑取3～5个单菌落进行革兰氏染色、镜检，观察菌体形态特征。

2.3 细菌PCR鉴定及分型

2.3.1 PCR引物

采用通用引物扩增16SrRNA基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。对疑似的绿脓杆菌菌株进行PCR鉴定。本实验所用PCR引物详见表1。

表1 本试验所用PCR引物

2.3.2 模板的制备

用扩增的纯化菌液，取1 mL加入1.5 mL离心管中，以10000 r/min离心10 min，弃上清液，加入100 µL ddH20混匀，煮沸15 min，12000r/min再离心15 min，取上清液即为模板。

2.3.3 PCR扩增

反应体系（40 µL）：PCR反应预混液Ex Taq™20 µL，无菌水18 µL，10 pmol/L上、下游引物各0.5 µL ，细菌基因组模板1 µL。PCR反应条件为：94 ℃变性5 min；30个循环，94 ℃变性40 s、56 ℃退火50 s、72 ℃延伸90 s，30个循环，72 ℃再延伸10 min，降温至4 ℃保存。

PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶上120 V电泳分离25 min，核酸染料染色，凝胶成像系统照相后观察分析。绿脓杆菌的PCR产物，由生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定，并对测序结果应用在线生物学软件，进行NCBI数据库搜索比对分析。

2.3.4 绿脓杆菌血清型分型

将绿脓杆菌菌种复苏后分别用接种环划线接种于PYG平板，置37 ℃培养18 h。各挑取单菌落再次分别划线接种于PYG平板，置37 ℃培养18 h，各用5 mL生理盐水将平板上的菌落洗下，制备成浓度均一的凝集原（菌数为8×109CFU/mL），2～8 ℃保存备用。准备洁净的载玻片，用记号笔分区标记后，取20 µL制备的绿脓杆菌凝集原滴于载玻片上，再取待检的水貂血清（简称待检血清）20 µL置于凝集原上，同时取20 µL绿脓杆菌凝集原加20 µL生理盐水作为阴性对照，取20 µL绿脓杆菌凝集原加20 µL绿脓杆菌抗水貂阳性血清（玻片凝集反应至少出现“+++”）作为阳性对照，用枪头将凝集原和待检血清混合，在30～60 s内用肉眼观察结果。

2.4 绿脓杆菌的小鼠毒力试验

对63株G、B、I型绿脓杆菌进行了小鼠半数致死剂量（50% Lethal Dose, LD50）的测定。

2.5 生化鉴定

按照文献[3]采用细菌生化鉴定管对纯培养物进行生化鉴定，接种后的发酵管置于隔水式培养箱中，培养18～24 h，统计生化试验结果。

2.6 药敏试验

按照K-B纸片扩散法进行药敏试验及结果的判断。

3 结果

3.1 细菌的形态与培养特性

绿脓杆菌在培养基上形成圆形、稍平、边缘不整齐或者呈波浪状、蓝绿色的菌落，有独特的芳香气味；革兰染色、镜检，分离菌株为革兰阴性小杆菌，单个散在或成对出现（见图1）。

图1 绿脓杆菌菌落形态及镜下形态

3.2 PCR鉴定结果

对分离菌株16 SrRNA 基因进行扩增，均扩增出大小为1421、1418 bp的DNA条带（见图2）。将分离菌株所测16SrRNA基因序列与GenBank中已收录核酸数据库进行同源性检索，经比对后确定菌株为绿脓杆菌，分别与登录号HQ641264.1、KF977858.1的绿脓杆菌16SrRNA序列同源性均为99%。

图2 绿脓杆菌的PCR控增结果

3.3 绿脓杆菌血清型分型

按绿脓杆菌血清型分型方法对分离菌株进行鉴定，各血清型菌株均能与对应的标准阳性血清发生特异性反应（见图3）。

图3 绿脓杆菌分型结果

3.4 G、B、I型绿脓杆菌的小鼠毒力试验结果

根据对63株绿脓杆菌的小鼠毒力试验结果，筛选出小鼠毒力试验中表现毒力最强的12株绿脓杆菌（4株G型、4株B型、4株I型）（见表2），标记为1～12号菌株。

表2 12株绿脓杆菌的小鼠毒力试验结果

3.5 生化鉴定

生化试验结果（见表3）表明，绿脓杆菌3种血清型12个菌株的十六烷三甲基溴化铵培养基上生长、明胶液化、硝酸盐还原产气试验、42 ℃生长试验结果均为阳性；绿脓菌素、氧化酶、乙酰胺培养基生长试验结果存在差异，同一血清型的不同菌株之间也存在明显差异。

表3 12株绿脓杆菌的生化鉴定结果

表4 12株绿脓杆菌的药敏试验结果

4 讨论

绿脓杆菌是引起水貂出血性肺炎的重要病原之一，水貂感染该菌后，以出血性肺炎和败血症为主要特征，发病急、死亡快，常呈地方性暴发，发病貂死亡率在10%～50%[4,5]。随着我国养殖毛皮动物的发病率持续上升，给毛皮动物养殖业造成了很大的经济损失。日本的Homma（1976）根据O抗原将绿脓杆菌分为A～N的14个血清型，生研公司根据该系统生产的标准阳性血清试剂盒被广泛应用于绿脓杆菌的血清学分析。白雪[6]等人于2011年采用日本生研公司的血清学分型系统对从各地患有出血性肺炎的水貂中分离到的45株绿脓杆菌进行了血清型分析，结果表明42株为G型，2株为B型，1株为I型，G型占93%，为主要流行血清型；丹麦的Hammer等人于2003年对72株貂源绿脓杆菌进行了血清型分析，其中75%为G型、8%为B型、C型占17%。本研究结果表明：引起水貂出血性肺炎的绿脓杆菌分离株主要血清型是G、B型，I型次之，这与白雪、Hammer等人研究结果一致。

本研究通过小鼠毒力试验筛选出12株毒力较强的菌株，进行了生化试验及药敏试验。生化试验结果表明：12株菌株的十六烷三甲基溴化铵培养基上生长、明胶液化、硝酸盐还原产气试验、42 ℃生长试验结果均为阳性；绿脓菌素、氧化酶、乙酰胺培养基生长试验结果存在差异，同一血清型的不同菌株之间也存在明显差异。药敏试验结果表明：12株菌株对强力霉素、林可霉素均耐药；对阿米卡星为敏感；对庆大霉素、阿莫西林、氨苄西林、新霉素均为耐药或介于中间；对环丙沙星、诺氟沙星、青霉素G、链霉素、多粘菌素B、四环素的敏感性不同；对氧氟沙星为敏感或介于中间，这可能与养殖场大量不合理地使用抗生素有关，有待进一步研究。

本研究对所分离到菌株的菌体形态、血清型、生化特性、药物敏感性等生物学特性进行了系统鉴定，为进一步客观评估水貂出血性肺炎的危害及其综合防控提供参考依据。