紫外消毒对养殖废水中大肠杆菌的灭活及影响因素

陈世珩，吕兆丰，郑添予，宗玉国，王道武*

1.长春工业大学化学工程学院，吉林长春 130012；2.延边大学，吉林延吉 133400；3.山东省潍坊市临朐县综合行政执法局，山东潍坊 261000

大肠杆菌广泛寄生于人与动物体肠道的条件致病菌，感染性很强，宿主受感染后易引发多种临床症状[1]。近年来大肠杆菌在不同环境中的传播均被报道过，包括食物、食用动物、不同的水环境尤其是污水中的传播。随着养殖业的快速发展，动物源大肠杆菌，特别是携带抗性基因的致病性的大肠杆菌对环境污染造成的危害日益突出。大肠杆菌可寄生于动物呼吸道或消化道上皮细胞中，是导致腹泻的重要病原之一。养殖业动物感染大肠杆菌后主要急性病例一般1～2 d死亡，亚急性1周左右死亡。体温正常或偏低。大肠杆菌在水环境中的潜伏期较长，可存活数月至一年之久。养殖废水中存在着大量抗生素耐药型病菌，是造成畜牧养殖业疾病的主要来源之一。大肠杆菌作为环境条件下的指示性微生物，可以间接反映水环境中的病菌污染程度。近些年，随着紫外灭活技术在不同领域的研究深入，发现紫外线消毒对不同种类细菌的影响具有差别性，例如革兰氏阳性菌对紫外线的耐受性高于革兰氏阴性菌[2]。

本研究选取了从养殖废水中分离纯化的多药耐药大肠杆菌，考察了紫外线对不同耐药表型大肠杆菌的灭活效果及环境因素对其影响因素，寻求高效、可行的控制水中大肠杆菌的方法和工艺，对推进大肠杆菌灭活的科学研究和技术开发有着非常积极的价值和意义[3]。

1 实验材料

1.1 菌株

所用大肠杆菌Ecoil.322鉴定为多药耐药大肠杆菌，耐药表型见表1。Ecoil.201（抗生素敏感菌株，由吉林畜牧提供）。

表1 大肠杆菌Ecoil.322耐药表型

Ecoil.322对β-内酰胺、头孢菌素、氨基糖苷、抗叶酸、喹诺酮、大环内酯、四环素、苯丙醇类等8类14种抗生素均有耐药性，仅对磺胺异恶唑表现为中介，对呋喃妥因表现为敏感（表1）。MIC检测结果表明Ecoil.322呈多重耐药，且耐药性严重。

1.2 培养基的配制

营养琼脂：取50 g营养琼脂粉，加入100 mL的蒸馏水与烧杯中，用玻璃搅拌充分后，封口烧杯放置高温灭菌锅中，设置121 ℃灭菌65 min，冷却50 ℃后缓慢倒入培养皿中，待至冷却。

LB肉汤（Luria-Bertani broth）的配制：称取150 g的营养琼脂粉，加入500 mFL的蒸馏水与烧杯中，用玻璃搅拌充分后，放置高温灭菌锅中，设置121 ℃灭菌65 min，冷却至室温后用无菌玻璃管进行分装。

1.3 实验装置

试验装置如图1所示．低压UVC灯为江苏南京胥光灯管，波长254 nm，功率为14 W[4]，装置下面暗室装有直径为40 cm的圆型转盘放置大肠杆菌样品，水槽及暗箱（外部封有锡纸）均为导光板[5]，可以控制中间的透镜来调控紫外强度。

图1 紫外实验装置图

2 实验方法

2.1 紫外线消毒实验

2.1.1 实验菌株的制备

分别挑选菌株接种于5 mL液体肉汤培养液中，于培养箱中37 ℃振荡过夜。24 h后，于菌液置4 ℃，10 000 r/min离心10 min，取沉淀用0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH7.2）冲洗沉淀1～2次，转入100 mL的蒸馏水后，显微镜下用血球计数板计数，制成大肠杆菌浓度约107CFU/mL的菌液样品。

2.1.2 紫外消毒实验

取3.5 mL大肠菌液样品于半径40 mm的灭菌培养皿中，放置在实验设备的暗箱室中。经紫外辐射强度仪测定辐照强度为100 µW/cm2，通过控制样品的辐射时间来获得不同紫外剂量。取时间间隔2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 min收集样品。每组实验进行3次重复性实验保证实验准确性，紫外消毒前后样品通过营养琼脂平板计数法测定大肠杆菌的浓度。灭活对数R的计算公式如下：

式中，N0是未经紫外线消毒时（原始）样品中的大肠杆菌浓度（CFU/mL）；NI是某一剂量紫外线消毒后样品中大肠杆菌的浓度（CFU/mL）。

2.1.3 不同环境因素对紫外线消毒效果影响试验

通过2.1.2节的实验，确定最佳的不同种类大肠杆菌灭活辐射剂量，以及在养殖废水常见水域环境条件下选择分别选定pH5、6、7、8、9，Cu2+浓度分别为15、30、60 mg/L。探究不同pH、离子强度浓度对紫外线的影响。

3 实验结果与讨论

3.1 相同紫外辐射剂量对不同大肠杆菌菌株的灭活

控制温度为22±1 ℃，浊度为1 ntu的实验条件下，耐药型和敏感型大肠杆菌的灭活对数均随着紫外辐射剂量的增加而增加，在紫外剂量辐射0～15 mj/cm2内增长十分迅速，之后逐渐缓慢，在到达20 mj/cm2后没有变化，在15 mj/cm2的辐照剂量下，大肠杆菌Ecoil.201和Ecoil.322的对数灭活率均值分别为2.12 log和1.82 log，之间有较为显著的差异。尽管耐药型大肠杆菌较敏感型大肠杆菌灭活速率较低，但20 mj/cm2以上的紫外线辐照剂量时，两株大肠杆菌对数灭活率都在2.0 log左右。以上，不同菌株灭活率的差异主要表现在低辐照剂量下。

3.2 pH对大肠杆菌紫外灭活的影响

控制温度为22±1 ℃，浊度为1 ntu的实验条件下，探究不同pH对紫外灭活的影响。在实验范围内随着pH的增加，灭活对数绝对值增加，碱性条件有一定促进大肠杆菌紫外灭活，酸性条件下抑制其紫外灭活，与大肠杆菌卵囊在不同环境下活性相关。在紫外剂量到达15 mj/cm2的时候，各个条件下灭活对数级都达到了1.5个对数级。因此，pH的改变对紫外条件下大肠杆菌的灭活有一定的影响，碱性条件下有一定的促进作用。

3.3 Cu2+离子对大肠杆菌紫外灭活的影响

控制温度为22±1 ℃，浊度为1 ntu的实验条件下，探究Cu2+不同浓度对紫外灭活的影响。水中金属离子强度对紫外灭活大肠杆菌的影响为，Cu2+浓度对灭活效率的影响可以忽略不计。随着Cu2+浓度从15 mg/L增加到60 mg/L，紫外灭活效率在10 mj/cm2内没有显著变化。总体而言，水中碱性金属离子的存在对紫外灭活大肠杆菌无明显影响。

4 小结

通过对养殖废水中筛选出的1株不同耐药表型的大肠杆菌和1株对抗生素敏感大肠杆菌进行紫外线消毒试验，取得以下结果。

4.1 耐药型和敏感型大肠杆菌的灭活对数均随着紫外辐射剂量的增加而增加，在紫外剂量辐射0～15 mj/cm2内增长十分迅速，之后逐渐缓慢，在到达20 mj/cm2后无显著变化，在15 mj/cm2的辐照剂量下，大肠杆菌Ecoil.201和Ecoil.322的对数灭活率均值分别为2.12log和1.82log，之间有显著的差异。当紫外辐射剂量为20 mj/cm2，对菌株Ecoil.322的灭活率为99.5%，菌株Ecoil.201的灭活率为99.1%，无显著差异。

4.2 随着pH升高，紫外灭活效率随着升高，pH降低对灭活有明显的抑制作用，灭活对数速率常数从0.00786下降到0.00382。

4.3 Cu2+离子不干扰紫外对隐孢子虫的灭活效率，随着Cu2+浓度从15 mg/L增加到60 mg/L相应的离子强度分别从40 mM增加到80 mM，紫外灭活效率在20 mj/cm2内没有显著变化。