易腐果蔬中杀菌剂残留检测技术研究进展

杜 营，侯广月，周莉莉，孙胜敏，刘丽洁，卞英芳，高 伟，刘 宁，李大为，徐志娇，孔 寒，孔 蒙，吴玲娟

（山东省产品质量检验研究院，国家加工食品质量检验检测中心（山东），山东济南 250102）

果蔬类农产品平均水分占比超过80%，给大部分细菌、真菌、酵母菌等微生物的生长繁殖提供了有利条件，导致果蔬腐败变质，甚至会对人体产生危害，引发食源性疾病[1-2]。

在果蔬的生产、流通、贮藏过程中，常使用有机杀菌剂，即通过使用化学物质来抑制或杀灭细菌、真菌等微生物来保证其产量和品质。有机杀菌剂对菌体的杀菌或抑制作用方式主要表现在破坏菌体细胞结构、干扰菌体细胞代谢和对菌体核酸、蛋白质合成产生影响三个方面。有机杀菌剂活性范围广、作用位点多，是减少果蔬采后腐烂的有效手段，也是流通贮藏期间广泛使用的保鲜措施[3]。

有机杀菌剂在保护果蔬生长、提高产量和保障储存质量等方面发挥了至关重要的作用，但杀菌剂残留不可避免地会对果蔬造成污染，从而对动物体及人体健康产生不良影响[4-6]。杀菌剂类农药残留问题已成为社会关注的重大食品安全问题之一，现行国家标准GB 2763—2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》对果蔬中近160 种杀菌剂的最大残留限量进行了规定[7]。农药残留最大限量标准的实施增强了农药的监管力度，因此采用先进的分析技术测定果蔬中多种杀菌剂农药残留尤为重要。本文阐述了近年来果蔬中杀菌剂类农药残留测定的前处理及检测技术进展，旨在推动建立一种更加快速、安全、高效、灵敏的果蔬中杀菌剂的检测分析技术。

1 果蔬中常用有机杀菌剂概况

有机杀菌剂通常是指能够有效防治和杀死病原微生物的有机化学药剂，按传导特性不同可分为内吸性杀菌剂和保护性杀菌剂。内吸性杀菌剂能被植物叶、茎、根、种子吸收进入植物体内，具有治疗和保护作用，如多菌灵、多霉清、霜疫清、甲霜灵等；保护性杀菌剂不能被植物内吸并传导、存留，不能用来防治深入植物体内的病害，只具有保护作用，如代森锰锌、福美双、百菌清等[8]。果蔬中常用的有机杀菌剂按原料来源主要分为有机硫杀菌剂、有机磷杀菌剂、有机氯杀菌剂、酰胺类杀菌剂、酰亚胺类杀菌剂、取代苯类杀菌剂、苯并咪唑类杀菌剂、三唑类杀菌剂和杂环类杀菌剂，见表1（见上页）。

表1 果蔬中常用有机杀菌剂的分类Table 1 Classification of common organic fungicides in fruits and vegetables

2 果蔬中常见杀菌剂前处理方法

样品前处理是果蔬中杀菌剂类农药残留分析检测的关键环节，主要包括提取、净化、浓缩等几个步骤，前处理过程影响检测的准确性和重现性，因此需要优化样品前处理过程中的各种因素[9]。近年来，随着杀菌剂类农药最大残留限量的降低，样品前处理技术也朝着更简单、快速、高效的方向发展。果蔬中有机杀菌剂类农药残留检测常用的前处理方法有固相萃取法、固相微萃取法、固相分散萃取法、超临界流体萃取法、凝胶渗透色谱法和QuEChERS 法等。表2 列出了果蔬中多种有机杀菌剂的前处理方法。

表2 果蔬中多种有机杀菌剂检测前处理方法Table 2 Various pretreatment methods for detecting organic fungicides in fruits and vegetables

2.1 固相萃取法

固相萃取法是利用固体吸附剂吸附样品中的目标化合物，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，从而达到分离和富集目标化合物的目的[18]。该技术试剂消耗量小、操作简单、回收率高、分离效果好、重现性好，也可与其他仪器联用实现自动化，在杀菌剂类农残检测中得到了越来越广泛的应用，但固相萃取柱大多是一次性的，虽然净化效果好，但样品用量较大时成本较高，浓缩过程耗时久[19]。Schermerhorn 等[20]采用C18 固相萃取技术结合液相色谱-串联质谱测定了果蔬中14 种三唑类农药和8种三唑类代谢物，回收率为60%～120%。周瑶等[21]采用氨基固相萃取柱前处理净化技术，建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定6 种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的方法，该方法操作简单，能满足果蔬中6 种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量的检测要求，重复性好。

2.2 固相微萃取法

固相微萃取法是在固相萃取技术基础上发展起来的集萃取、浓缩和进样于一体的前处理技术，可与多种检测技术联用，具有操作简单、省时安全、灵敏度高、选择性好、无需溶剂等显著优点，应用前景广阔[22]。但由于固相微萃取技术所需装置价格比较昂贵，对于挥发性差的物质分析效果不理想、重现性不高，一定程度上限制了其应用。Navalon 等[23]采用顶空固相微萃取前处理方法，研究了pH 值、离子强度、萃取和脱附时间及萃取温度对葡萄、草莓和西红柿中嘧霉胺和醚菌酯残留的影响，方法回收率为91.6%～104.8%。Munitz 等[24]采用固相微萃取前处理方法，研究了嘧菌酯和唑菌胺酯在蓝莓中的残留检测，该方法选择性好、准确度和灵敏度高。

2.3 固相分散萃取法

固相分散萃取是在样品提取液中加入固相吸附剂，经涡旋、离心，最后取上清液进行测定的过程。这种方法能同时实现样品均质、提取和净化，仅需要少量样品和溶剂，不需要特殊的仪器设备[25]，但这种方法存在提取条件优化复杂、自动化程度不高、样品用量小但需要混合均匀等问题。Wu 等[26]建立了固相分散萃取-液相色谱串联质谱法测定水果蔬菜中酰胺类杀菌剂的方法，酰胺类杀菌剂的平均回收率为72.4%～98.5%。Guo 等[27]采用基质固相分散萃取前处理方法，通过液相色谱-串联质谱对果蔬中的苯并咪唑类杀菌剂及其代谢物进行测定，在1～500 ng/g 水平范围内，该方法的平均回收率在70%～110%范围内。

2.4 超临界流体萃取法

超临界流体萃取法是利用超临界流体从液体或固体中萃取出特定成分，以达到分离的目的[28]。这种前处理方法具有有机溶剂用量小、简单快速、自动化程度高、可与气相色谱联用等优点，在果蔬等样品的前处理中应用较多，但是这种萃取体系的可选择性较小、设备价格高昂，因而制约了该技术的推广使用[25]。李新社[29]采用超临界二氧化碳流体萃取蔬菜中的残留农药，由于超临界二氧化碳呈化学惰性，它不会影响样品分析的准确性，且其萃取效率较高，可广泛应用于萃取蔬菜中的残留农药。王建华等[30]采用超临界流体萃取果蔬中多种有机磷残留，样品中农药残留回收率可达82%～108%。

2.5 凝胶渗透色谱法

凝胶渗透色谱分离是一种物理过程，能够很好地分离有机大分子物质，有效降低了基质干扰，提高了杀菌剂类农药残留前处理效率，同时具有回收率高、载荷量大、自动化程度高等优点，但凝胶渗透色谱本身也有其局限性，若样品基质中的小分子杂质与待测物相对分子量相近则很难分离[31]。Christensen 等[32]采用乙酸乙酯和环己烷提取、凝胶渗透色谱净化的前处理方法，对水果中嘧菌酯、醚菌酯和肟菌酯的残留进行检测，这三种杀菌剂的方法回收率为70%～114%。传统的离线凝胶色谱法虽然能有效分离有机大分子物质，但前处理过程需使用大量的有机溶剂洗脱后再进行浓缩，耗时较长。田丽等[14]利用在线凝胶色谱净化结合三重四极杆气质联用仪建立了筛查食品中农药残留的分析方法。这种方法能有效减少试剂消耗，降低基质对目标物质的干扰，同时可通过大体积进样来提高检测灵敏度，有利于样品中痕量农药残留的筛查。

2.6 QuEChERS 技术

QuEChERS（quick easy cheap effective rugged safe）前处理技术是一种基于分散固相萃取技术而形成的样品前处理技术，原理与高效液相色谱和固相萃取相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。这种方法具有简单、高效、快速、安全、价格低廉等显著优点，目前已广泛应用于果蔬中农药残留的检测分析[33-36]。毕思远等[37]采用QuEChERS 前处理方法结合气相色谱-串联质谱法建立了葡萄等浆果中7 种酰胺类杀菌剂残留量的测定方法，他提出，QuEChERS 前处理方法具有操作简单、试剂消耗量小、准确度高等显著优点。龚蕾等[38]建立了改进的QuEChERS提取和净化方法，结合超高效液相色谱-串联质谱法测定果蔬中18 种琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂。该方法操作简单、净化效果好，适用于果蔬中新型琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的快速检测。

3 果蔬中常见杀菌剂检测技术

随着现代分析化学技术的提高，杀菌剂检测技术迅速发展，杀菌剂残留检测主要采用气相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法和免疫分析技术等。表3（见下页）列出了果蔬中常见的有机杀菌剂仪器检测技术。

表3 果蔬中多种有机杀菌剂仪器检测技术Table 3 Various instrumental techniques for detecting organic fungicides in fruits and vegetables

3.1 气相色谱法

气相色谱法（gas chromatography，GC）具有操作简便、选择性高、分离效能好、灵敏度高、分析快速以及应用范围广等特点。对于易挥发且不会发生分解的杀菌剂均可采用气相色谱法进行检测，可以实现一次进样、待测组分得到完全分离的效果。

吴俐等[49]建立了同时测定6 种三唑类杀菌剂残留量的气相色谱方法。6 种三唑类杀菌剂在样品添加水平为0.05～0.20 mg/kg 时，方法检出限为0.002～0.007 mg/kg，可同时满足植物源性食品中多种三唑类杀菌剂残留量的检测需要。吴洁珊等[50]建立了一种同时测定柑橘中四种杀菌剂残留量的气相色谱法，外标法定量，醚菌酯、肟菌酯、唑菌胺酯和烯肟菌酯的方法检出限分别为5、5、10、10 μg/kg。张晶等[51]建立了福美铁、丙森锌和代森锰三种杀菌剂类农药残留的气相色谱-火焰光度检测器测定方法，提高了二硫代氨基甲酸盐类杀菌剂的检测专一性。该方法操作简单、定量准确可靠，能够满足农药残留检测的要求。

3.2 气相色谱-串联质谱法

气相色谱-串联质谱法（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS），是将气相色谱仪的高效分离能力与质谱仪独特的选择性、灵敏度、相对分子质量和分子结构鉴定能力相结合的一种分析检测技术[52]，具有定性能力强、灵敏度高、高效快捷等特点，现已广泛应用于农药残留检测中，特别是在农药代谢物、降解物的检测和多农药残留检测等方面具有显著优势。

李继革等[53]建立了同时测定水果中11 种三唑类杀菌剂残留量的气相色谱-串联质谱方法，该方法基质效应和背景干扰低、灵敏度高，11 种三唑类杀菌剂的方法定量限均在0.8～3.4 μg/kg 之间，低于国家标准及有关文献报道值，可用于水果中三唑类杀菌剂的同时测定。张瑶等[54]建立了气相色谱-串联质谱测定蔬菜中啶氧菌酯、醚菌酯、醚菌胺等10 种杀菌剂残留的检测方法，这10 种蔬菜杀菌剂线性关系良好，方法检出限为0.1～0.5 μg/kg。范良彪等[55]建立了气相色谱-串联质谱法测定3 种食用菌中6 种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留量的分析方法，该方法具有前处理速度快、操作简便、重复性好、准确度高等优点。张晶等[56]建立了香菇样品中福美双、丙森锌和代森联3 种杀菌剂的气相色谱-串联质谱检测方法，方法操作简便、灵敏度高、定量准确可靠，各项指标均能满足农药残留检测要求。

3.3 高效液相色谱法

高效液相色谱法（liquid chromatography，LC）可以解决气相色谱技术的一些局限，尤其适用于高沸点、热稳定性差、强极性、离子型以及大分子化合物的检测分析[57]，现已成为有机杀菌剂残留检测不可缺少的重要方法。

朱群英等[58]建立了同时测定豆芽中多菌灵、福美双和百菌清等11 种植物生长剂和杀菌剂的在线固相萃取-高效液相色谱分析方法，通过优化在线固相萃取条件和色谱分离条件，实现了11 种植物生长调节剂和杀菌剂的有效分离，精密度和准确度良好。杨涛等[59]提出了高效液相色谱法同时测定果蔬中10 种防腐杀菌剂的方法，这10 种防腐杀菌剂的方法检出限在0.02～0.05 mg/L 之间。

3.4 液相色谱-串联质谱法

液相色谱-串联质谱法（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS），是将液相色谱与质谱联接起来的方法，用于分析对热不稳定、分子量较大、难以用气相色谱分析的农药残留，具备几乎通用的多残留分析能力。它能结合液相色谱和质谱二者的优点，具有检测灵敏度高、选择性好、定性定量可同时进行、能够提供待测组分结构信息等优点[60]。尽管液相色谱-质谱联用法对分析技术和仪器的要求高，它仍是一种很有利用价值的高效率、高可靠性的农药残留分析技术。

孙亚米等[61]建立了果蔬中16 种新型酰胺类杀菌剂的液相色谱-串联质谱快速分析方法。该方法定量限在3.0×10-4～0.01 mg/kg 之间，完全能够满足果蔬中16 种新型酰胺类杀菌剂残留量的分析要求。徐潇颖等[62]建立了高效液相色谱-串联质谱法同时快速测定水果蔬菜中7 种甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂残留的方法。样品采用HPLC-MS/MS 电喷雾正离子多反应模式监测，基质标曲进行外标法定量。该方法操作简单，重复性好，基质干扰少。

3.5 免疫分析法

免疫分析是以抗原抗体特异性识别和结合反应为基础的分析方法，通过对半抗原或抗体的标记，利用标记物的生物、物理或化学放大作用，对样品中特定的农药残留物进行定性定量检测。免疫分析具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点，一般不需要贵重仪器，可大大简化甚至省去前处理过程，目前已广泛应用于农药残留的快速检测中[63-65]。

Watanabe 等[66]建立了单克隆抗体酶联免疫吸附检测百菌清的方法，并检测了黄瓜、苹果等4 种农产品中的百菌清含量，该方法I50值为0.34 ng/g，检出限为0.052 ng/g。柳双等[67]基于多菌灵多克隆抗体建立了直接竞争酶联免疫吸附测定方法检测果蔬中的多菌灵残留，该方法校正曲线的检测限为（0.30±0.15）μg/L，灵敏度为（2.70±0.30）μg/L。

4 小结与展望

作为分析工作中非常重要的一环，有机杀菌剂前处理技术不断发展，目前QuEChERS 技术已成为检测果蔬中有机杀菌剂的主要手段，这种技术具有简单、高效、快速、安全、价格低廉等显著优点，但这种方法也存在基质效应明显、方法灵敏度不高等问题。在实际分析检测过程中需要根据果蔬样品特性、目标杀菌剂化合物特性等来优化前处理方法。而在果蔬类农产品杀菌剂的检测方面，LC-MS/MS 法具有检测灵敏度高、选择性好、定性定量准确、结果可靠等优点。尽管这种方法对分析技术和仪器设备的要求较高，但它仍是一种很有利用价值、高效可靠的农药残留分析技术。

综上所述，QuEChERS 法结合LC-MS/MS 技术将是果蔬中杀菌剂残留检测分析的主流技术，但仍存在基质效应、回收率不高等问题。未来随着检测手段和仪器设备的不断升级发展，相应技术手段也将不断完善。

杀菌剂市场不断更新迭代，随着人们生活水平及环保意识的提高，高毒杀菌剂将逐步淡出市场，未来我国有机杀菌剂将朝着广谱、高效、低毒及无交互抗性的方向发展。杀菌剂的快速发展也对其残留量检测提出了更高要求，未来杀菌剂类农药残留检测将朝着快速、高效、灵敏度高等方向发展：一是将发酵学、细胞学和生物芯片等生物技术和化学分析技术相结合，提高分析选择性和灵敏度；二是研究和开发出快速、准确度高且能进行高通量筛查的痕量检测技术。