鲜切西兰花贮藏过程中腐败细菌的多样性分析

程媛媛，古静燕，陈宇航，岳凤丽，安玉龙，秦淋淋

（1.山东农业工程学院食品科学与工程学院，山东省教育厅重点实验室：特色农产品采后品控与综合利用，山东济南250100；2.济南悟通生物科技有限公司，山东济南250100）

西兰花别名花椰菜，原产于地中海东部沿岸地区，其植株茎部顶端膨胀为绿色或紫色的花球，是主要的食用部分。因富含丰富的糖类、脂类、氨基酸、维生素和胡萝卜素等，西兰花营养成分居于同类蔬菜之首，被誉为“蔬菜皇冠”[1]。研究证明，西兰花具有清化血管、解毒肝脏以及缓解耳鸣健忘、脾胃虚弱等病症的功效[2]。然而因西兰花花球圆正、紧密、品质优良，花蕾细小，花茎不空心，微生物易潜伏其中，从而造成西兰花的腐败，影响西兰花的贮存。随着人们生活节奏的日益加快和消费能力的增强，鲜切蔬菜产品行业得到了长足的发展，鲜切西兰花也因营养全面而受到人们的欢迎。但鲜切蔬菜容易因鲜切造成组织损伤，细胞受损，汁液外流，极易腐烂变质，严重影响产品的销售和质量安全[3]；而且鲜切蔬菜比一般蔬菜产品更容易滋生微生物，因此分离鉴定出其冷藏过程中与腐败相关的微生物意义重大。

不同蔬菜上的优势微生物群落千差万别，如鲜切青椒上主要是欧文氏菌属，芽孢杆菌和假单胞菌属在鲜切生菜上属于优势菌种，这些微生物不仅能够分解果胶，而且可以在低温下存活并繁殖，最终引发鲜切蔬菜组织的腐败[4,5]。目前，国内外关于鲜切西兰花的研究主要涉及切割方式、贮藏温度、保鲜剂、包装方式等几个方面[6-10]，对于其优势腐败微生物的研究较少。筛选、鉴定其中的优势腐败菌，研究其特性，为有针对性的杀菌处理提供理论基础和技术支持，并对优化控制鲜切西兰花的加工过程提供参考。本研究以市售绿鹦鹉西兰花为材料，进行鲜切工艺处理，采用稀释平板法分离腐败的鲜切西兰花样品中的优势菌株，依据细菌菌落特征，进行多次纯化培养后得到纯种菌，通过16S rDNA 序列分析进行菌种鉴定。然后选择代表菌株进行唯一碳源培养实验，以便分析西兰花中污染细菌的多样性以及可能致腐原因，为研究西兰花的贮藏保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

西兰花品种为绿鹦鹉，2018 年4 月7 号采摘于云南昆明呈贡区菜园。经采摘、修剪后包装（规格为5 kg），4℃预冷12 h，4 月9 号运至济南匡山农产品交易市场，当天运送至山东农业工程学院食品科学与工程学院微生物实验室，放于4 ℃冰箱备用。

1.2 试剂

平板计数琼脂培养基，北京奥博星生物技术有限责任公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase，宝生物工程（大连）有限公司；pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，北京全式金生物科技有限公司；细菌基因组提取试剂盒及琼脂糖凝胶回收试剂盒，北京天根生化科技有限公司；果胶、木聚糖、甘露聚糖、壳聚糖、透明质酸、黄原胶等，北京索莱宝生物科技有限公司；硫酸铵、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、纤维素、羧甲基纤维素、微晶纤维素、淀粉等，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

DYCP-32DN 型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；GelDoc XR+凝胶成像仪，美国Bio-Rad 公司；SHP-450 恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；Mastercycler nexus 梯度PCR 仪、5810R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；YSQ-50SII 高压蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 鲜切西兰花样品的制备

挑选新鲜西兰花为试材，用锋利的无菌刀具切分成直径约为3～4 cm 的花球，以无菌水冲洗，沥去多余的水分，装入塑料小筐。置于4 ℃下贮藏备用。

1.4.2 菌落总数的测定

每隔2 d 取出冷藏的鲜切西兰花样品，一式3 份，分别在无菌操作条件下准确称量25.0 g 西兰花，充分研磨后加入到225 mL 0.85%灭菌生理盐水中，振荡混匀后可得到浓度为10%（w/V）的匀质研磨稀释液，立即抽取1 mL 稀释液进行梯度稀释，参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2-2016）对菌落总数进行计数[11]。

1.4.3 优势腐败菌的分离与纯化

取冷藏10 d 的鲜切西兰花，按照1.4.2 的方法进行系列梯度稀释，选择3 个合适的稀释度倾注平板，每个稀释度重复3 次，置于36 ℃下培养48 h。待平板上生长出菌落后，挑选形态不同、存在生长优势的单菌落，通过平板划线法反复分离纯化，镜检，得到单一菌株。将纯化得到的优势菌进行菌种保藏，置于-80 ℃冻存备用。

1.4.4 优势腐败菌的鉴定

（1）形态学观察

菌落形态观察：观察不同菌落的大小、颜色、质地、形状、边缘结构以及表面形态等。

菌体形态观察：挑取单一菌种进行16 h 的培养，制成标本，并在显微视野下对细胞形态、排列方式等进行观察。

（2）菌株的分子鉴定

模板DNA 的制备：在培养基中将上述挑取的优势菌株进行活化培养，离心收集菌体。使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行优势菌全DNA 的抽提，测定浓度后放于-20 ℃保存备用。

PCR 扩增：采用通用引物序列27F（5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′）对菌株的16S rDNA 基因进行扩增。

PCR 反应体系（20 μL）：通用引物27F 和1492R 各1 μL（10 pmol/L），模板DNA（100 ng/μL）1 μL，dNTP Mix 10 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.1 μL，超纯水6.9 μL。

PCR 扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保藏。

PCR 扩增产物检测及测序：用胶回收试剂盒提取并纯化PCR 扩增产物。取5 μL 纯化产物，按照1:5 的比例与上样缓冲液混合，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳。电泳验证后，连接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector，转化到E.coli DH5α。通过氨苄抗生素进行抗性筛选，获得阳性克隆。16S rDNA 基因测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，将得到的序列与GenBank 上的标准菌株16S rDNA 序列进行比对，选取同源性在98%以上的菌株构建系统发育树。

（3）腐败菌的唯一碳源培养

为配制多糖利用分析培养基，向离子培养基（硫酸铵4 g，氯化钠1.25 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，双蒸水1 000 mL，pH7.0）中分别添加10 种多糖底物至终浓度为0.1%（w/v），在115 ℃高压下灭菌20 min 后，得到10 种唯一碳源培养基。

根据系统发育树分析，其中两大分支的代表菌种进行唯一碳源培养，36 ℃、200 rpm/min 培养3～5 d。分别用不含任何碳源的离子培养基，及含0.10%（w/V）葡萄糖的唯一碳源培养基进行对照组实验，观察菌体悬浊度，监测OD600，判断菌株对多糖底物的利用能力，对代表菌株的降解特性进行初步鉴定。

1.4.5 数据处理及分析

实验数据使用Microsoft Excel 2007 处理并作图，采用SPSS 16.0 统计软件进行LSD 分析。测序后的序列与GenBank 中收录的标准菌株的16S rDNA 基因序列进行比对，应用MEGA 6.0 软件中的Neighbour-Joining 法构建系统发育树[12]。

2 结果与分析

2.1 鲜切西兰花冷藏过程中菌落总数变化

分别对4 ℃冷藏0～12 d 的鲜切西兰花样品进行微生物菌落总数计数，结果如图1 所示。微生物菌落计数结果表明，鲜切西兰花的微生物菌落总数与西兰花样品的冷藏时间呈正相关性。冷藏前4 d，菌落总数增长缓慢；超过4 d 后，菌落总数开始出现指数性增长；在第10 d时可达到7.4×106CFU/g（新鲜样品菌落总数为1.8×103CFU/g）；冷藏至12 d 后，菌落总数已达到5.5×107CFU/g。一般认为蔬菜初期腐败时菌落总数约为106 CFU/g[13]，因此，可以认为本试验的鲜切西兰花样品在冷藏第10 d 时开始腐败。

图1 鲜切西兰花冷藏过程中菌落总数的变化Fig.1 Change in the total colony of fresh-cut broccoli during cold storage period

2.2 腐败菌的分离及鉴定

2.2.1 菌株的形态学观察

采用稀释倾注平板法从冷藏10 d 的鲜切西兰花样品中分离腐败菌，根据菌落形态特征及数目可将所有菌落大致分为8 组，分别编号P1～P8。腐败菌的菌落及细胞形态特征如表1 所示。由于实验中对优势菌的分离及筛选主要依照其形态、质地、颜色等特征，因而不排除筛选出的菌株属于同一种属的可能性。

从表1 中可以看出，这8 株菌有6 株为杆菌，2 株为球菌，且两株球菌菌落特征明显不同，初步判断为不同种属的细菌。6 株杆菌综合分析其菌落特征和个体形态，P2、P5，P6、P7 与P8 无明显差别，可能为同属的菌株，而P1 与其他5 株杆菌有较明显的差别。

2.2.2 分子生物学鉴定

对筛选得到的8 株菌株提取其基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳结果显示，样品DNA 条带清晰，大小符合要求，可作为PCR 模板。以1492R、27F 为引物，经PCR 扩增，得到稳定、清晰的条带，片段大小约1 500 bp，说明8 株菌的16S rDNA 均被成功PCR 扩增出来（图2）。

图2 8 株腐败菌16S rDNA 的PCR 扩增结果Fig.2 PCR amplification for 16S rDNA of 8 spoilagebacteria

图3 显示的是贮藏在4 ℃的鲜切西兰花腐败细菌的系统发育树，由系统发育树可知，P1 与高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）DSM 21631 亲缘关系最近，相似性为99.59%；P2 与恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）ATCC 12633 亲缘关系最近，相似性为98.97%；P3 与小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）ATCC 51145 亲缘关系最近，相似性为99.32%；P4 与木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）ATCC 29971 亲缘关系最近，相似 性 为 99.79%；P5 与 克 雷 伯 氏 菌（Klebsiella pneumonia）ATCC 13884 亲缘关系最近，相似性为100%；P6 与克雷伯氏菌（Klebsiella quasipneumoniae）DSM 28211 亲缘关系最近，相似性为99.58%，P7 与沙雷氏菌（Serratia plymuthica）ATCC 183 亲缘关系最近，相似性为99.45%；P8 与沙雷氏菌（Serratia glossinae）DSM 22080 亲缘关系最近，相似性为99.79%。

表1 菌株的形态学特征Table 1 Morphological characteristics of strains

图3 贮藏在4 ℃的鲜切西兰花腐败细菌的系统发育树Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree showing the relationship between sequences of dominant spoilage bacteri a of fresh-cut broccoli storage at 4 ℃

2.2.3 P2 与P3 的多糖利用能力分析

根据系统发育树分析，8 菌株明显分为两大分支，第一分支包含恶臭假单孢菌P2、克雷伯氏菌P5 和P6 以及沙雷氏菌P7 和P8，第二分支包含高地芽孢杆菌P1、葡萄球菌P3 和P4。结合2.2.1 结果分析分别选取第一分支杆菌代表菌株P2、第二分支球菌代表菌株P3 分析其多糖利用能力，探索可能对鲜切西兰花的致腐原因。结果如图4 所示，在无碳源的阴性对照培养基中检测不到菌株；菌株P2、P3 都能利用陆生高等植物来源的多糖，如微晶纤维素、羧甲基纤维素、木聚糖、甘露聚糖、淀粉和果胶；菌株P2 还可以利用来源于甲壳动物的壳聚糖，而菌株P3 可以利用来源于微生物的黄原胶。综合分析，两株代表菌P2、P3 都可以在多种含植物多糖的唯一碳源培养基中生长，显示出对植物多糖的显著降解能力，这在一定程度上说明该类菌容易在鲜切西兰花上滋生，其致腐能力较强。

图4 P2、P3 菌株在唯一碳源培养基中生长的菌液浓度分析Fig.4 Analysis of the concentration of bacterias P2 and P3 growing in the sole carbon source medium

3 结论

对于鲜切果蔬来说，其表面微生物特别是腐败菌数量的多少会直接影响产品的货架寿命[14]。本试验研究结果表明，鲜切西兰花在冷藏过程中的优势腐败细菌主要为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）、恶臭假单孢杆菌（Pseudomonas putida）、葡萄球菌（Staphylococcus spp.）、克雷伯氏菌（Klebsiella spp.）、沙雷氏菌（Serratia spp.）。其中，5 株细菌为革兰氏阴性菌，这可能与贮藏条件有关，革兰氏阳性菌的最适生长温度为20～30 ℃，而革兰氏阴性菌则可在较低温度下生长繁殖[15]。大量研究结果显示，恶臭假单胞菌是果蔬低温冷藏下的优势腐败菌，这可能与蔬菜组织含酸量低，易遭受土壤微生物如假单胞菌、欧文氏菌等的侵染有关[16]。

另外，按照菌体形态随机选择系统发育树上两大分支的代表菌株P2 和P3，进行了唯一碳源培养实验，发现两株代表菌P2、P3 都可以在多种含植物多糖的唯一碳源培养基中生长，显示出对植物多糖的显著降解能力，这在一定程度上说明该类菌容易在鲜切西兰花上滋生，其致腐能力较强。

综上，这一结果为鲜切西兰花冷藏过程中的微生物腐败进程和机制提供了生物学证据。后期在研究鲜切西兰花产品保鲜策略时，可针对优势腐败菌采取抑菌措施；同时，这些腐败微生物也可以作为鲜切西兰花产品质量安全系统评价的潜在指标。