高效液相色谱法测定葡萄中甜蜜素的残留量

张晓燕，崔晨，夏光辉

（通化师范学院，吉林通化134002）



高效液相色谱法测定葡萄中甜蜜素的残留量

张晓燕，崔晨，夏光辉

（通化师范学院，吉林通化134002）

建立了高效液相色谱法测定葡萄中甜蜜素残留量的方法。采用InertsilC18（4.6×250mm）色谱柱，柱温25℃，乙腈：水=60：40作流动相，检测波长为313nm，流速0.8mL/min的条件测定。甜蜜素标准品以不同体积进样，获得标准曲线y=360.86x-106.89，其相关系数R2=0.9999，在2～50μg范围内呈良好的线性关系。实验建立的甜蜜素测定方法稳定可靠，可快速检测葡萄中的甜蜜素残留量。

甜蜜素；高效液相色谱；葡萄；残留量

甜蜜素，别名环己基氨基磺酸钠，化学分子式C6H11NHSO3Na，白色，粉末状结晶，主要由环己胺和氨基磺酸等化学物质经过一系列反应后通过氢氧化钠处理，重结晶产生的物质［1，2］。它是一种人工合成食品添加剂，无味，无营养［3］。因其可以增加食品口感，价格低廉，具有低热，易溶于冷水、热水，无异味，对热、酸、碱稳定以及不易变质和不吸潮等特点而被广泛应用于食品行业中，其中不乏饮料、西瓜、糕点、罐头、酱菜、蜜饯、葡萄、香瓜、菠萝等多种食品［4］。但甜蜜素的致癌作用一直存在争议，早在1960年就有人报告其代谢产物环己胺对心脑血管系统和睾丸有毒理作用而被美国食品与药品管理局（FDA）禁用［5］。后来经过多方研究证实，摄入过量甜蜜素确实有损害肾脏功能甚至致畸、致癌等副作用，因此很多食品生产大国，例如美国、日本、加拿大等发达国家，都明令禁止食品生产商在食品中添加甜蜜素，从根本上阻止甜蜜素流入市场［6］。但仍有许多国家允许甜蜜素作为食品添加剂活跃在市场中，例如中国、澳大利亚等国家和地区，只是针对甜蜜素的使用范围和使用量做出了相应的控制，因此大量的含有甜蜜素的食品在市场上流通［7］。但是甜蜜素的食用量过多，甚至达到一定量的时候，就会对人体产生一定的危害，尤其是人体的肝脏和神经系统这些敏感部位，特别是针对敏感的孕妇和小孩以及抵抗力较差的老人这些特定人群，更容易受到甜蜜素的伤害［8］。因此我国控制甜蜜素的使用剂量，并纳入到《食品中添加剂使用卫生标准》，但其中不包括对水果中甜蜜素残留量的要求。查阅文献可知，澳大利亚和新西兰规定甜蜜素在低热量果蔬汁制品中的最大使用限量为400mg/kg，欧盟规定在低热量的水果和蔬菜制品中甜蜜素的使用量不得超过250mg/kg［9］。

葡萄作为一种人们喜爱的水果，不仅味道好，而且还具有一定的预防疾病的功效。近年来人们越来越关注食品安全问题，所以对葡萄是否喷洒甜蜜素的问题有所质疑。目前在国标GB/T5009.97-2003里已经有关于甜蜜素检测方法的介绍，其中比较常见的有气相色谱法、薄层层析法和比色法［10］。另外也有人研究了分光光度法、离子色谱法等来测定甜蜜素的残留量［11］。但都存在着干扰性大、操作繁琐、灵敏度低和稳定性差等方面的问题［12］。本实验建立高效液相色谱法对葡萄中甜蜜素的残留量进行定量检测，操作简单、快速、灵敏。

1　材料与方法

1.1材料、试剂和仪器

1.1.1材料和试剂

材料：巨峰葡萄（超市购买）；

试剂：乙腈（色谱纯）；硫酸（分析纯）；正己烷（色谱纯）；次氯酸钠（分析纯）；碳酸氢钠（分析纯）；甲醇（色谱纯）；

甜蜜素标准品（250mg，中国食品药品检定研究院，纯度：99.0%，产品编号：C11830800，Lot：30426）。

1.1.2仪器

UV-2600紫外分光光度计、HHS型电热恒温水浴锅、FA1104电子天平（感量：0.1mg）、BT125D电子天平（感量：0.01mg）、LC-20A高效液相色谱仪。

1.2方法

1.2.1样品溶液的制备

将葡萄去除籽粒，放入研钵中捣碎研磨成汁，将研磨后样品放入80℃恒温水浴锅中加热20min。首先精确秤取5.0g样品，确保样品精准度，并将称量的样品全部放置100mL容量瓶中，随后加入蒸馏水，定容至刻度，反复摇匀，过滤。精密量取续滤液10mL，全部放入125mL分液漏斗中，随后先加入2mL（1:1）硫酸，再放入5mL正己烷，最后放入2mL（1:1）次氯酸钠溶液，反复摇晃震动10min。待乳化现象消失后弃去下层水相，保留正己烷层。精确量取25mL碳酸氢钠溶液加入分液漏斗中，充分震荡5min。待乳化现象消失后弃去水层，取正己烷层。用0.45μm的滤膜过滤，作为样品溶液，待测。

1.2.2标准品溶液的制备

精确称取10mg甜蜜素标准品，置于10mL容量瓶中，加适量蒸馏水溶解，然后用蒸馏水定容至刻度，配制成1.0mg/mL的甜蜜素标准品溶液。将标准溶液按1.2.1处理，作为甜蜜素标准溶液，现用现配。

1.2.3色谱条件

色谱柱为Inertsil4.6nm×250nm，流动相乙腈:水=60:40，检测波长为313nm，流速为0.8mL/min，柱温为40℃。

2　结果与分析

2.1高效液相色谱法色谱条件的选择

2.1.1检测波长的选择

利用紫外分光光度计对衍生反应生成的N，N-二氯环己胺在200～700nm范围内进行波长扫描，发现在210nm和313nm处都出现了比较明显的色谱峰，但210nm周围产生的杂峰多，分离度较差。而313nm处出现的干扰峰较少，基线相对稳定，所以采用313nm作为甜蜜素的检测波长。

2.1.2流动相的选择

分别以20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20的不同比例的乙腈:水作为流动相进行洗脱，发现当乙腈: 水=60:40时，分离度和色谱峰形都比较好，且能有效的排除干扰峰的影响，故选择乙腈:水=60:40作为流动相。

2.1.3柱温和流速的选择

根据不同的柱温条件进行选择，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、温度下进行检测。结果在25℃时出现的色谱峰形较好，杂峰和干扰峰较少，所以选用25℃作为柱温条件。

在本实验中，分别选择以下：0.6mL/min、0.8mL/min、1.0mL/min、1.2mL/min作为甜蜜素检测时的流速，最终确定流速为0.8mL/min。

2.2定性分析

首先进样甜蜜素标准溶液10μL，再进样品溶液10μL，根据甜蜜素标准溶液和样品溶液出峰时间做定性分析，判断葡萄中含有甜蜜素。结果如图1和图2所示。

由图1可知，甜蜜素标准溶液在5.873min处出现明显的色谱峰。由图2可知，样品溶液在5.870min处同样出现明显的色谱峰，可以确定样品中有甜蜜素残留。

图1　甜蜜素标准溶液色谱图

图2　样品溶液的色谱图

2.3精密度试验

取标准溶液10μL注入色谱仪，进行检测，并且平行进样6次分别检测，得到6组峰面积数据，分别为33677、33604、33728、33714、33670、33664，计算测得值的相对标准偏差RSD=1.18%，说明本方法测得结果的精密度良好。

2.4标准曲线的绘制

标准溶液以不同体积进样分析，分别为2μL，5μL，10μL，20μL，50μL，以峰面积y作为纵坐标，进样体积x作横坐标，得到标准曲线y=360.86x-106.89，相关系数R2=0.9999，甜蜜素在2～50μg范围内呈良好的线性关系。

图3　甜蜜素标准曲线图

结果的计算：按样品的峰面积根据标准曲线进行定量分析，按以下公式计算结果：

其中，X—样品中甜蜜素含量（g/kg）；M1—样品中甜蜜素的质量（μg）；m—样品质量（g）；v—进样体积（μL）；5—正己烷加入量（mL）.

计算可得，样品中甜蜜素的质量为14.45μg，样品中甜蜜素的含量为1.31mg/kg。

2.5重现性试验

将同一样品进行三次平行实验，按1.2.1处理后进行测量，三次测量的峰面积分别为10575、10562、10571，计算得到样品中含有甜蜜素的质量分别为 29.60μg、29.57μg、29.59μg，RSD=1.58%，说明本实验所采用的方法准确度较高。

2.6稳定性试验

标准溶液分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h进行测定，结果在8h峰形开始发生变化，10h峰形完全变化，衍生物分解成其他物质，说明N，N-二氯环己胺在8h内稳定存在，其稳定性满足测定的要求。

2.7回收试验

将样品分别秤取10g放置1号、2号、3号容量瓶，1号加入5μg/mL甜蜜素标准品，2号加入10μg/mL甜蜜素标准品，3号加入20μg/mL的甜蜜素标准品，按照1.2.1方法进行处理，测得值分别为0.0435μg、0.0894μg、0.1721μg。计算回收率分别为87%、87%、86%，RSD=1.54%。其数值介于国家标准GB/T27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测规定的回收率（80%～110%）之间，符合规定。由此可以看出本方法测量准确可靠，满足分析要求。

3　结论

建立的高效液相色谱法测定葡萄中甜蜜素含量的方法，其精密度的相对标准偏差RSD=1.18%，该方法的精密度较好。标准曲线y=360.86x-106.89，其相关系数R2=0.9999，在2～50μg范围内呈良好的线性关系。甜蜜素在8h内稳定存在，满足甜蜜素的检测时间要求。甜蜜素的回收率在86%～87%，符合规定。通过检测得到样品中甜蜜素的残留量为1.31mg/kg，没有超过欧盟甜蜜素含量标准250mg/kg，实验样品葡萄中的甜蜜素残留量是合格的。综上所述，高效液相色谱法测定甜蜜素的残留量的方法，其灵敏度以及精密度相对与其他测定甜蜜素方法更加精准、快速，能够满足国家标准对甜蜜素测定的要求，为日后检验人员研究甜蜜素的测定方法提供了参考，在水果的质量检验中具有实际应用价值。

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Determination of Sodium Cyclamate Residues in Grapes by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Xiao-yan，CUI Chen，XIA Guang-hui
（Tonghua Normal University，Tonghua 134002，China）

A high performance liquid chromatography（HPLC）method for the determination of sodium cyclamate residues in grapes was established.The chromatographic separation was performed on an Inertsil C18column（4.6×250mm）kept at 25℃using acetonitrile and water（60：40）as the mobile phase at a flow rate of 0.8mL/min and the detection wavelength was set at 313 nm.Different volume of sodium cyclamate standard were injected，the standard curve wasy=360.86x-106.89，with a correlation coefficient of 0.9999，it showed good linearity over the concentration range of 2 to 50μg.This method was stable and reliable for the rapid determination of sodium cyclamate residues in grapes.

Sodium cyclamate；HPLC；grapes；residues

TS255.7

A

1008-1038（2016）08-0026-04

2015-10-29

张晓燕，女，助教，主要从事食品有害成分研究