石蝉草总木脂素含量测定方法建立及提取工艺优选

时间：2024-05-22

李福森黄媛恒黄晓亮李映新

摘要［目的］建立石蝉草总木脂素含量测定的方法并通过正交试验优选石蝉草总木脂素的最佳提取工艺。［方法］以五味子乙素为对照品绘制标准曲线，采用变色酸－硫酸显色体系，紫外-可见分光光度法测定石蝉草乙醇提取物中总木脂素含量；采用L9（34）正交试验法，以总木脂素含量为考察指标，优选石蝉草总木脂素的提取工艺。［结果］五味子乙素在4.00～24.00 μg/mL线性关系良好（R2=0.996 1），平均回收率为97.68%，RSD为1.11%，石蝉草总木脂素优化的提取工艺为8倍量80%乙醇回流提取3次，每次2 h。［结论］该含量测定方法准确、简便、经济，适用于石蝉草总木脂素的含量测定，优选得到的提取工艺可为石蝉草总木脂素的提取提供参考。

关键词石蝉草；总木脂素；含量测定；提取工艺；正交试验

中图分类号 R284 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）14-0183-02

作者简介李福森（1973—），男，广西百色人，副教授，硕士，从事植物化学研究。*通信作者，正高级实验师，博士，从事天然产物药理活性研究。

收稿日期 2022-09-06；修回日期 2022-10-13

石蝉草（Peperomia dindygulensis Miq）为胡椒科草胡椒属（Peperomia Ruiz et Pavon）植物，分布于我国南方的各省区，以全草入药，味辛，性凉，具有清热解毒、化疲散结、利水消肿的功效，主治肺热咳嗽、麻疹、疮毒、癌肿等症［1］。《云南中草药选》中记载用其治疗胃癌、食道癌、肝癌、乳腺癌、肺癌。石蟬草主要含木脂素类、黄酮类、聚酮类等化学成分，其中木脂素类含量较高［2-6］，现代药理研究发现，草胡椒属木脂素类具有抗肿瘤、抗炎、抗病原微生物、除草活性等药理活性［2，7-10］。目前，对石蝉草开展的研究很少，其木脂素类成分的含量测定以及提取工艺研究鲜见报道。石蝉草主要木脂素成分草胡椒素A～E（peperomin A～E）多含亚甲二氧基［7］，该研究采用变色酸-硫酸显色体系以及紫外分光光度法测定石蝉草总木脂素含量，并采用L9（34）正交试验对石蝉草总木脂素提取条件进行优化。

1 材料与仪器

1.1 试材石蝉草购于本地药材市场，经广西医科大学生药学教研室朱丹博士鉴定为胡椒科草胡椒属植物石蝉草（Peperomia dindygulensis Miq）的全草，药材粉碎后过3号筛，60 ℃干燥后备用。

1.2 试剂五味子乙素对照品（HPLC≥98%，上海源叶生物科技有限公司，批号 P29J8F38066）；无水乙醇、甲醇、变色酸、硫酸均为分析纯，水为纯化水。

1.3 仪器 UV-1240型紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；204型电子分析天平［梅特勒托利多科技（中国）有限公司］；HH-2数显电热恒温水浴锅（江苏金坛友联仪器研究所）；R1010 型旋转蒸发器（郑州长城科工贸有限公司）；KWY-102 型电热干燥箱（武汉市武昌实验仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备精密称取五味子乙素对照品 2 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得浓度为 0.2 mg/mL 的对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备取石蝉草约10 g，加80 mL 80%乙醇回流提取3次，每次3 h，合并提取液并过滤，滤液减压蒸干，取提取物10 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤。

2.3 测定波长的选择各取对照品溶液和供试品溶液于10 mL 刻度试管中，按照变色酸-硫酸显色法，于70 ℃水浴挥干溶剂后，依次加入0.5 mL 10% 变色酸水溶液、3 mL 浓硫酸， 1.5 mL蒸馏水，沸水浴中放置30 min，流水冷却，试剂空白同法操作。于400～800 nm扫描吸收光谱，经显色后，对照品溶液和供试品溶液均在560 nm处有最大吸收，故选择在560 nm作为测定波长。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察。各取对照品溶液 100、200、300、400、500、600 μL 于 10 mL刻度试管中，按照“2.3”条件显色后，于560 nm 处测吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，考察线性关系。得到回归方程Y=33.298X+0.048 1（R2=0.996 1），表明五味子乙素在4.00～24.00 μg/mL 线性关系良好。

2.4.2 精密度试验。取对照品溶液 400 μL，按照“2.3”条件显色后，连续 6 次测定吸光度，计算得到吸光度的 RSD为0.11%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验。取供试品溶液 400 μL，按照“2.3”条件显色，分别在 0、5、10、15、20、25、30 min 测定吸光度，计算得到吸光度的RSD为2.38%，表明在30 min内样品稳定性良好。

2.4.4 重复性试验。按照“2.2”操作方法制备6份供试品溶液，各精密量取400 μL，显色并测定吸光度，带入标准曲线计算总木脂素含量，计算得到总木脂素含量的RSD为1.77%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验。精密量取6份已知总木脂素质量的供试品溶液，精密加入五味子乙素对照品溶液300 μL，按照标准曲线制备方法操作显色并测定吸光度，计算样品平均回收率及 RSD，结果见表1。

2.5 石蝉草总木脂素提取工艺优化

2.5.1 正交试验设计。以乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取次数（D）作为考察因素，每个因素取3个水平（表2）。称取石蝉草粗粉50 g，共称9份，分别按照L9（34）正交试验法进行提取，各组提取液过滤，回收溶剂并真空冷冻干燥至恒重。

2.5.2 正交试验结果。分别精密称取“2.5.1”获得的提取物10 mg于10 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，过滤后各取400 μL续滤液，按照“2.3”操作，将吸光度代入标准曲线，以总木脂素含量为考察指标，对试验结果进行分析。根据直观极差（R）分析结果（表3）可知，影响石蝉草总木脂素提取效果的因素从大到小依次为D＞C＞B＞A，最佳提取工艺为A1B3C2D3，即80%乙醇以1∶8（g∶mL）的料液比回流提取2 h，共提取3次。经过方差分析（表4）可知，提取次数、料液比、乙醇浓度、提取时间对提取效果无显著影响。

2.5.3 验证试验及结果。称取石蝉草粗粉50 g，按优选的提取工艺进行3次平行提取，得到总木脂素的平均含量为22.18 mg/g，RSD为1.72%。

3 讨论

目前，中药中总木脂素的含量测定多采用分光光度法，因天然产物中的木脂素类成分中多含亚甲二氧基，该基团于浓硫酸作用下水解生成甲醛，甲醛与含酚羟基的变色酸反应生成紫红色产物，可以利用此特征采用分光光度法测定总木脂素含量［11］。据报道，石蝉草主要化学成分为草胡椒素A （peperomin A），具有亚甲二氧基的特征结构，五味子乙素也含有亚甲二氧基，两者均可以在变色酸-硫酸体系中显色，且均在560 nm处有最大吸光度［7］，因草胡椒素A标准品难获得，故用五味子乙素作为对照品，采用分光光度法对石蝉草总木脂素类进行含量测定。方法学研究结果表明，精密度、稳定性、重复性、加样回收率均符合规定的要求，说明该方法可用于石蝉草中总木脂素含量的测定。

通过4因素3水平正交试验，以乙醇提取液中总木脂素含量为考察指标，优选石蝉草总木脂素的最佳提取工艺。通过试验及数据分析，得出石蝉草总木脂素最佳提取工艺为：80%乙醇为提取试剂，以石蝉草粉末的8倍量提取3次，每次提取2 h。该研究可为石蝉草木脂素的提取和含量测定提供试验依据。

参考文献

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