基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A方法与酶联免疫法的对比研究

邓昌良 李泳宁 叶雅沁

摘要 ［目的］比较基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A（OTA）方法与酶联免疫法。［方法］建立核酸适配体检测OTA标准曲线，进行样品加标回收率试验，并与酶联免疫法进行比较。［结果］核酸适配体法检测OTA在0.05～10.00 ng/mL具有较好的线性，饲料样品中添加OTA的回收率为92.0%～93.5%，与酶联免疫法相比，2种方法之间具有较好的一致性。［结论］该研究建立的基于核酸适配体检测OTA方法灵敏度高、准确度好，为研究饲料中OTA的快速检测方法奠定基础。

关键词 核酸适配体；赭曲霉毒素A；检测；酶联免疫法；饲料

中图分类号 S816.17  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）14-0189-03

作者简介 邓昌良（1990—），男，福建龙岩人，助理实验师，从事药物分析研究。

*通信作者，副教授，博士，从事微生态制剂研究。

赭曲霉毒素是曲霉属和青霉属的某些菌株产生的代谢产物，其中赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA） 最为常见，具有肝肾毒性、致畸、致癌、遗传毒性和免疫毒性等毒副作用，广泛存在于大麦、小麦、玉米、啤酒和香料等农产品中［1-3］。而饲料中常见的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素、OTA、伏马菌素和T-2毒素等［4-6］，其中OTA是较易污染的霉菌毒素，严重威胁着动物和人体安全。因此，为保证饲料产品的安全使用，建立高效、快速、准确的霉菌毒素检测方法显得尤为重要。

目前，检测OTA的方法主要有液相色谱法［7］、液相色谱-质谱联用法［8］、胶体金色谱法［9］、酶联免疫吸附法［10］和电化学传感器法［11］等。液相色谱法是目前检测OTA最常用的定量分析方法，灵敏度较高，但需要进行样品纯化后进行检测；液质联用法灵敏度可达0.1 ng/mL，但其对设备要求较高；酶联免疫吸附法则多适用于大规模样品的检测，但其灵敏度和特异性也有待于提高。近年来快速发展的灵敏度高和特异性强的核酸适配体检测技术，成为国内外的研究热点。该研究前期已建立了基于核酸适配体的赭曲霉毒素A检测方法［12］，在此将该方法用于饲料样品中OTA的检测并与酶联免疫法进行比较，考察该方法建立的准确性。

1 材料与方法

1.1 试验材料 4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）为北京Solarbio公司产品，链亲和素购为上海源叶生物公司产品，牛血清白蛋白（BSA）和OTA为美国Sigma-aldrich公司产品；OTA核酸适配体5′-biotin-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-Cy3-3′，结合序列5′- BHQ2-TGTCCGATGC-3′由福州尚亚公司合成。赭曲霉毒素A酶联免疫反应检测试剂盒为美国REAGEN公司产品。其他试剂均为分析纯。多功能酶标仪（SpectraMax M3）为美国MD公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 核酸适配体法检测OTA。在96孔微孔板中加入100 μL 链亲和素 （100 μg/mL），4 ℃包被过夜。扣干，用PBS缓冲液清洗3次，再次扣干；用1%BSA进行封闭2 h后，用PBS缓冲液清洗3次，扣干。加入100 μL核酸适配体（200 nmol/L），25 ℃振荡孵育30 min，PBS缓冲液清洗3次，扣干。再加入100 μL的标准品溶液或提取后的样液，37 ℃反应30 min，PBS缓冲液清洗3次，扣干。最后加入100 μL互补序列（400 nmol/L），37 ℃反应30 min，PBS缓冲液清洗3次，扣干。采用酶标仪检测荧光强度，激发波长为550 nm，吸收波长为570 nm［12］。OTA标准曲线的测定，将OTA标准品采用甲醇进行溶解，再用HEPES缓冲液 （pH 7.0，120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、20 mmol/L MgCl2、20 mmol/L CaCl2）稀释成0、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00 ng/mL标准液，标准液加至已经加入100 μL核酸适配体按上述方法进行加样检测，采用酶标仪检测荧光强度，根据标准品浓度与荧光强度制作标准曲线。

1.2.2 酶联免疫法检测OTA。

根据赭曲霉毒素A酶联免疫反应检测试剂盒说明书进行检测。加入50 μL的标准品或样品于所设定的孔中；每孔加入50 μL一抗，振荡混匀 1 min；37 ℃下避光温育30 min；倒掉板孔内液体，加入1×洗液350 μL洗板5次，最后一次洗板后将酶标板倒置用力甩干；每孔加入100 μL二抗，振荡混匀1 min；37 ℃下避光温育30 min；倒掉板孔内液体，加入1×洗液350 μL洗板5次，最后一次洗板后将酶标板倒置用力甩干。加入100 μL 四甲基联苯胺，混匀1 min，室温（22.5±2.5）℃温育15～20 min，加入50 μL终止液；酶標仪450 nm下读OD值。OTA标准曲线的测定，用检测试剂盒中已配好OTA标准液（0、1、3、9、27、81 ng/mL），按上述方法进行加样检测，采用酶标仪于450 nm波长处测定OD值，根据标准品浓度与相对吸光度制作标准曲线。

1.2.3 饲料样品处理及加标回收率测试。从市场收饲料样品数个，粉碎后备用。根据赭曲霉毒素A酶联免疫反应检测试剂盒说明书，准确称取2.0 g粉碎样品于50 mL离心管中，加10 mL 70%甲醇，振荡5 min，室温下4 000 r/min离心10 min；取1 mL上清，加入1 mL碳酸氢钠溶液（0.1 mol/L），振荡，取50 μL进行分析。选择未检出OTA的饲料样品进行加标回收率试验，分别向2.00 g饲料粉碎样品中添加OTA标准品（通过液体稀释后加入），使其样品中含有1.0和10.0 ng/g OTA，提取后采用酶联免疫法和核酸适配体法进行检测样品中OTA含量，计算加标回收率。

2 结果与分析

2.1 OTA标准曲线的建立

将OTA标准品溶液稀释成不同浓度标准液，分别加至已包被好的96孔微孔板中，按“1.2.1”和“1.2.2”方法反应后，采用酶标仪检测荧光强度，根据标准品浓度与荧光强度制作标准曲线。酶联免疫法则按说明书进行操作，根据标准品浓度和相对吸光度制作标准曲线。结果如图1所示。

从图1可以看出，核酸适配体法在OTA浓度0.05～10.00 ng/mL建立标准曲线，其标准方程为Y = 4 543X+11 739（R2=0.986 1），最低检测限为0.05 ng/mL；而根据酶联免疫法检测试剂盒说明书在1～81 ng/mL建立标准曲线，其标准方程为Y=-30.31X+74.86（R2=0.995 8），最低检测限为1.00 ng/mL。

2.2 饲料样品中OTA的检测

从市场收集饲料样品数个，根据OTA酶联免疫反应检测试剂盒说明书进行提取，选择未检出OTA的饲料样品进行加标回收率试验，分别采用核酸适配体法和酶联免疫法进行测定，计算饲料样品的OTA回收率，結果如表1所示。

从表1可以看出，在饲料样品中添加OTA标准品，采用2种方法进行检测，其检测值具有较好的一致性。在饲料样品中OTA标准品添加量1.0 ng/g，核酸适配体法检测的回收率为92.0%，略高于酶联免疫法（89.0%）；在饲料样品中添加10.0 ng/g OTA标准品，则酶联免疫法检测的平均回收率（95.8%）略高于核酸适配体法（93.5%）。可见，该研究建立的核酸适配体法具有较好的准确度。

2.3 2种方法的比较

从表2可以看出，核酸适配体法检测灵敏度较高，检测限达到0.05 ng/mL，且反应时间较短（反应时间从加入待测样品或标准品进行反应开始计算），工作中OTA标准品的回收率为92.0%～93.5%，表明该研究建立的检测方法具有较高的准确度。而与酶联免疫法相比，由于酶联免疫法采用的是显色法，其检测限较低，仅有1.00 ng/mL，但在较高浓度样品的检测中具有较高的回收率。

3 结论与讨论

近年来，食品、农产品和饲料中的霉菌毒素污染时有报道，特别是农产品和饲料产品，不仅影响动物生长和繁殖，并且可能随着食物链进入人体，进而对人体健康造成一系列严重的安全问题，其安全性越来越受到人们重视。因此，为保障食品、农产品和饲料的安全使用，建立新型的高灵敏霉菌毒素检测方法是保障其安全的重要手段。

目前，已有大量的新型检测技术被应用于霉菌毒素的检测方法，特别是近年来报道了大量能特异性结合霉菌毒素的核酸适配体［13］，也开发了基于核酸适配体检测黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素等的检测方法［14-16］。核酸适配体是一段能与目标物进行特异性结合的寡核苷酸序列，由于其核酸特性，具有容易合成、反复使用和保存等的优点。因此，国内外已有报道了多种基于核酸适配体检测OTA的技术方法［17］，如Wei 等［18］开发了一种新的基于核酸适配体检测OTA的电化学生物传感器，采用碳气凝胶和亚甲基蓝（MB）作为信号放大策略，其检测线性范围为0.10～10.00 ng/mL，实际检测限可达到1.0×10-4 ng/mL。Li等［19］建立了一种基于核酸适配体检测谷物样品中的多重真菌毒素的新型高通量光子晶体微球悬浮阵列，该检测系统OTA的检测范围可达到0.1 pg/mL～0.1 ng/mL。曲瑶等［20］开发了基于核酸适配体检测OTA的传感器，其检出限达到0.67 nmol/L。以上方法的检测灵敏度均较高，可以对饲料和农产品中的痕量霉菌毒素进行分析检测，但由于检测操作和设备要求上都较高，难以在大量样品的分析检测中进行应用。

该研究建立的基于核酸适配体检测OTA的方法，操作简单、灵敏度高，检测浓度为0.05～10.00 ng/mL，最低检测限可达到0.05 ng/mL，在饲料样品中加标回收率高，与酶联免疫法相比具有较好的一致性，不仅可以作为大规模样品分析检测的方法，同时也为建立检测多元霉菌毒素的新型分析方法奠定基础。

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