蒜头果蛋白氨基酸组成分析

袁燕 宋鹏飞 菅博书 崔穆峰

摘要 采用酸水解法测定蒜头果蛋白的氨基酸组成，结果发现，蒜头果蛋白的氨基酸组成丰富，含有17种氨基酸。根据其精确分子量推算，得出每个蒜头果蛋白分子的各氨基酸残基数约为503个。其中酸性和碱性氨基酸残基含量分别为23.06%和13.32%，说明蒜头果蛋白是一种酸性蛋白质；亲水作用较强的氨基酸残基占总氨基酸残基数的50.3%，说明该蛋白在水溶液中的溶解性比较好，便于用09%生理盐水溶解其干粉样品，为蒜头果蛋白作为药品的开发利用提供了便利条件。

关键词 蒜头果蛋白；酸水解；氨基酸组成

中图分类号 Q517  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2023）14-0192-02

作者简介 袁燕（1975—），女，江西新余人，副教授，博士，从事蛋白质的分离纯化及分子作用机制研究。

蒜头果（Malania oleifera Chun et S.Lee）又名猴子果、山桐果、马兰后（壮语）等［1］，属于铁青树科（Olacaceae）蒜头果属，是我国特有的单种属稀有植物［2］，已被列为国家二级保护树种、广西重点保护野生植物［3］。在自然界分布很窄，仅见于我国广西西部的大新、龙州、右江流域各县和云南东部的富宁、广南等地。蒜頭果种子中富含油脂，含油率高达670%，主要成分为油酸、硬脂酸和棕榈酸，可作为合成麝香酮的理想原料，具有较高的经济价值［4-5］。

蒜头果蛋白是从蒜头果种子中分离纯化出来的一种新的Ⅱ型核糖体失活蛋白。该蛋白具有非常强的抗肿瘤活性，对人宫颈癌HeLa细胞的半抑制浓度（IC50）为1.54×10-10 mol/L，其IC50值均远远小于具有抗肿瘤、抗病毒活性的天花粉蛋白（4.10×10-5 mol/L）和广谱抗癌药物顺铂（1.59×10-6 mol/L），说明该蛋白具有用于免疫毒素治疗癌症的应用前景［6］。由于蒜头果蛋白的氨基酸序列还未知，为了更清楚地了解其抗肿瘤活性及结构的关系，该研究采用酸水解法测定蒜头果蛋白的氨基酸组成，为后续研究蒜头果蛋白的一级结构打下基础。

1 材料与方法

1.1 设备与试剂

氨基酸自动分析仪（日立835-50型）；蛋白纯化系统（KTA Explorer 100，Amersham）；Milli-Q纯水机（MILLIRORE公司）；万分之一天平（Sartorius，BP110S）。100 μmol/L 17种氨基酸标准液（Beckman）；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 蒜头果蛋白样品的获取。

将200 g蒜头果种子去外壳，按种仁与20 mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液1∶5比例用组织捣碎机捣碎，纱布过滤，离心（8 000 r/min，4 ℃），上清液用30%～80%硫酸铵分段盐析，离心（8 000 r/min，4 ℃），沉淀用20 mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液溶解，在蛋白质纯化系统上过柱体积为20 mL的疏水色谱层析柱［HiprepTM phenyl FF（High sub）］，用ddH2O按0～100%线性梯度洗脱，280 nm紫外检测，流速为4 mL/min，每管5 mL自动收集［7］。样品纯度用12.0% SDS-PAGE电泳检测。

1.2.2 蒜头果蛋白样品的水解。准确称取1.000 mg蒜头果蛋白样品于水解试管中，加6 mol/L HCl溶液2～4 mL，混匀后放入冷冻剂中，冷冻3～5 min后抽真空，充入氮气30 s，立即旋紧盖子，110 ℃水解22 h，待玻璃管冷却后开管，水解液在70～80 ℃水浴中蒸干，加少量蒸馏水再蒸干，重复3次［8］。

1.2.3 蒜头果蛋白氨基酸组成的测定。将HCl挥发后的样品用适量pH 2.2柠檬酸钠缓冲液溶解，0.4 μm微孔滤膜抽滤或13 000 r/min离心15 min，滤液或上清液于氨基酸自动分析仪进行分析各氨基酸的含量［9］。

2 结果与分析

2.1 蒜头果蛋白样品的获取

图1为蒜头果蛋白样品在蛋白纯化系统上分离纯化的色谱层析图。从图1可以看出，主要有4个峰，分别标为峰I、峰Ⅱ、峰Ⅲ和峰Ⅳ，通过SDS-PAGE电泳检测发现峰Ⅳ即为蒜头果蛋白，收集峰Ⅳ溶液，真空冷冻干燥成干粉，置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.2 蒜头果蛋白氨基酸组成分析

2.2.1 氨基酸组成分析。从图2和表1可以看出，蒜头果蛋白的氨基酸组成丰富，含有17种氨基酸组分。根据各氨基酸的摩尔百分比和蒜头果蛋白精确分子量（61 875 Da）推算出在蒜头果蛋白分子中各种氨基酸的个数，总和为503个。其中脂肪族氨基酸基为86.88%（共437个）；芳香族氨基酸残基为5.76%（共29个）；杂环族氨基酸占7.36%（共37个）。酸性氨基酸残基及其酰胺为23.06%（共116个）；碱性氨基酸残基为13.32%（共67个），说明蒜头果蛋白是一种酸性蛋白质，这与蒜头果蛋白的等电点为5.5是一致的。

在蒜头果蛋白总氨基酸残基数中，以天冬氨酸（67个）为最多，达14.4%，这里可能包括天门冬酰胺，因为天门冬酰胺在有酸或碱存在下容易水解并生成天冬氨酸。天冬氨酸和含量排第三的谷氨酸（可能包括谷氨酰胺）同属于酸性氨基酸［6］，一般带负电荷，以酸根形式存在，在蛋白质内以盐键形式与正电荷基团连接。谷氨酸的带负电荷的γ-羧基常位于蛋白质分子表面，能与钙结合，可能蒜头果蛋白含有非常高的钙离子。

在总氨基酸残基数中，残基数排第三的是丝氨酸（49个），它与含量比较高的苏氨酸（32个）同属于羟基氨基酸。由于侧链带有极性基团，具有一定的亲水性。氨基酸残基带有羟基侧链者化学上比较活泼，常作为活性残基而进行研究其功能具有十分重要的意义。

2.2.2 疏水性和亲水性分析。从表1可以看出，蒜头果蛋白中具有较强疏水作用的亮氨酸（39个）、缬氨酸（36个）、脯氨酸（29个）、异亮氨酸（20个）、苯丙氨酸（16个）和甲硫氨酸（2个）等残基占总氨基酸残基数的29.7%，说明蒜头果蛋白的疏水作用比较强，这与“1.2.1”试验中用疏水色谱层析柱一步就可以将该蛋白分离纯化出来的结果是一致的。

此外，蒜头果蛋白中具有较强亲水作用的丝氨酸（49个）、苏氨酸（32个）、天冬氨酸（67个）、谷氨酸（49个）、精氨酸（47个）和赖氨酸（12个）等残基占总氨基酸残基数的50.3%，由此可以推断蒜头果蛋白在水溶液中的溶解性比较好，便于用0.9%生理盐水溶解蒜头果蛋白干粉样品，为蒜头果蛋白作为药品的使用提供了便利条件。

3 讨论与结论

蛋白质氨基酸组成的测定方法主要有酸水解、碱水解和酶水解，在水解过程中，逐渐降解成分子量越来越小的肽段，直到最后成为氨基酸的混合物。酶水解不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但水解不彻底，需要几种酶协同作用才能使蛋白质完全水解，且需要时间较长，所以主要用于蛋白质部分水解，在氨基酸组成测定中用的较少。碱水解一般与5 mol/L NaOH共煮10～20 h，可使蛋白质完全水解，但水解过程中多数氨基酸遭到不同程度的破坏，且产生消旋现象，不过色氨酸却是稳定的［10］。酸水解是氨基酸组成测定方法中最常用的方法，其优点是不引起消旋作用，得到的是L-氨基酸，缺点是色氨酸完全被沸酸所破坏，羟基氨基酸（丝氨酸、苏氨酸）有一小部分被分解，同时酰胺基被水解下来［11］。该研究采用酸水解法测定蒜头果蛋白的氨基酸组成，虽然在该试验中没有色氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺的数据，但根据蒜头果蛋白精确分子量已推算出每个蛋白质分子中各氨基酸残基数的近似值为503个，是一种酸性蛋白质，可能含有非常高的钙离子，疏水作用比较强，水溶性也很好，此结果为后期深入研究蒜头果蛋白结构与功能关系奠定基础。

参考文献

［1］ 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第24卷［M］.北京：科学出版社，1988.

［2］ 傅立国.中国植物红皮书：稀有濒危植物（第一册）［M］.北京：科学出版社，1992：480.

［3］ 广西林業局保护站等.广西壮族自治区重点保护野生植物资源调查报［R］.2001.

［4］ 李用华，朱亮锋，欧乞钅咸.蒜头果油合成麝香酮简报［J］.云南植物研究，1983，5（3）：238.

［5］ 袁燕，梅双喜.蒜头果蛋白的红外光谱及圆二色谱分析［J］.安徽农业科学，2016，44（33）：116-117.

［6］ 袁燕，张薇，戴建辉，等.荧光光谱法研究蒜头果蛋白与金属离子的相互作用［J］.光谱学与光谱分析，2014，34（12）：3297-3300.

［7］ YUAN Y，DAI X C，WANG D B，et al.Purification，characterization and cytotoxicity of malanin，a novel plant toxin from the seeds of Malania oleifera［J］.Toxicon，2009，54（2）：121-127.

［8］ 朱奕凡，王妍，汪国云，等.不同杨梅品种果实游离氨基酸组成分析［J］.浙江大学学报（农业与生命科学版），2021，47（6）：736-742.

［9］ 刘振艳，杨文钦，钞虹，等.玉米须水提物氨基酸组成分析及营养价值和风味评价［J］.中国食品添加剂，2022，33（6）：109-114.

［10］ 陈惠黎.生物大分子的结构和功能［M］.上海：上海医科大学出版社，1999：4-9.

［11］ 沈同，王镜岩.生物化学［M］.2版.北京：高等教育出版社，1990：196-224.