ABA在小麦幼胚培养中的应用研究

摘要 为提高小麦幼胚体细胞再生频率，以豫麦49、豫麦18、兰考906为试验材料，研究不同浓度ABA对小麦幼胚离体培养特性和草酸盐氧化酶活性的影响。结果表明，不同基因型间、ABA浓度间小麦幼胚愈伤组织诱导率、分化率和草酸盐氧化酶活性差异均达到极显著水平，基因型间以豫麦18最高，兰考906最低；不同ABA浓度间以0.10 mg/ L 处理对幼胚愈伤组织形成和分化最为有利；不同浓度ABA条件下小麦幼胚胚性愈伤组织诱导率与草酸盐氧化酶活性存在极显著相关。

关键词 小麦；幼胚；ABA；胚性愈伤组织；培养特性；草酸盐氧化酶

中图分类号 S512.1 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）06-0018-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.06.006

Application of ABA in Immature Embryo Culture of Wheat

HE Sheng－lian

（Wheat Research Institute，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract In order to improve the regeneration frequency of somatic cells of wheat immature embryo，the effects of different ABA concentrations on tissue culture of immature embryo callus and oxalate oxidase activities of immature embryogenic callus were studied with Yumai 49，Yumai 18 and Lankao 906 as the research materials.Results showed that the differences of induction frequency of emryogenic callus and differentiation rates of callus and oxalate oxidase activities of immature embryogenic callus were extremely significant different between different ABA concentrations or genotypes，which were the highest in Yumai 18 and the lowest in Lankao 906 among different genotypes.Treatment with 0.10 mg/L between different ABA concentrations was most beneficial for immature embryogenic callus formation and differentiation.Induction frequency and oxalate oxidase activities of immature emryogenic callus of wheat  was extremely significant between different ABA concentrations.

Key words Wheat;Immature embryo;ABA;Embryonic calli;Cultural characters;Oxalate oxidase

在小麦的各种外植体中，幼胚是再生植株最有效的外植体［1-7］，小麦幼胚诱导产生的再生体系具有多方面的应用价值。但是，这一体系的建立受到诸多因素的影响，如外源植物激素［6-11］、供体的基因型［6-7，9，11］、幼胚的发育成熟程度（胚龄）［12-16］及其他环境条件等［17-18］。

脱落酸在植物组织培养中的应用最早主要集中在双子叶植物及模式植物胡萝卜的体胚发生研究上。早期的研究认为，适当浓度的脱落酸可抑制不正常胚状体的形成，防止胚状体过早萌发［19］。但也有研究者发现，在胡萝卜离体培养中使用0.1 μmol/L的脱落酸，胡萝卜胚状体有些不正常［20］。脱落酸在禾本科植物的组织和细胞培养中也有应用，张栋等［21-23］研究发现，适当浓度ABA对愈伤组织分化有利。于晓红等［9］研究发现，在小麦幼胚进行离体培养时，脱落酸对晚期幼胚的胚性愈伤组织诱导有促进作用，在愈伤组织诱导培养过程中加入适量的脱落酸有助于胚性愈伤组织的形成。

在組织培养过程中，草酸盐氧化酶通过催化产生过氧化氢促进细胞壁纤维素组成成分的交联，加强初生细胞壁，限制细胞壁的膨胀，使细胞保持在一种致密的、非液泡状态下， 从而促进胚性愈伤组织的形成［24］。Caliskan等［24-27］研究表明，小麦和燕麦种子萌发过程中，草酸盐氧化酶催化所产生的过氧化氢参与了细胞壁纤维素组成成分的交联，草酸盐氧化酶通过参与细胞壁的重新构建，控制着细胞的生长发育进程。由此可见，草酸盐氧化酶是胚性愈伤组织形成过程中的一个关键酶。鉴于此，笔者以冬小麦品种豫麦49 、豫麦18和兰考906为试验材料，通过研究不同浓度ABA 对小麦幼胚组织培养特性和草酸盐氧化酶活性及其之间的关系，探讨小麦幼胚高效再生体系建立的生理机制，以期为组织培养技术在小麦改良中应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 试验材料选用冬小麦品种豫麦18、豫麦49、兰考906。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基。

诱导培养基：含2.0 mg/L 2，4-D的MS培养基（MS+ Gln 250 mg/L+蔗糖60 g/L+琼脂8 g/L，pH= 5.8）。

继代培养基：含2.0 mg/L 2，4-D的MS培养基中加入ABA（0、0.05、0.10、0.50 mg/L）。分化培养基：1/2 MS+1.0 mg/L IAA+2.0 mg/L ZT+蔗糖60 g/L+琼脂8 g/L，pH 5.8。诱导及继代条件为25 ℃、无光照。分化条件为25  ℃ 、光照16 h/d、光照度2 500 lx。

1.2.2 幼胚的选择及培养。

开花期选择生长一致的麦穗挂牌标记，于开花后13～14 d取标记麦穗带回实验室，置4 ℃冷藏保存待用，接种时剥出中部小穗下部第1、2位小花籽粒，经75%酒精消毒30 s和0.1%升汞消毒10～15 min，无菌水洗3～5次。在无菌条件下将幼胚剥出，盾片向上接在诱导培养基上，放入25 ℃培养箱培养。诱导培养21 d后的初始愈伤组织，在诱导培养基上继代培养14 d后，一部分先后转移到继代培养基，再诱导培养12 d后统计胚性愈伤组织诱导率，然后转入分化培养基，并于14 d后统计分化率；同时取另一部分胚性愈伤组织在液氮中处理30 s，然后保存于- 80  ℃冰箱，以备测定草酸盐氧化酶活性。

1.2.3 草酸盐氧化酶活性的测定。草酸盐氧化酶活性的测定方法参照Lane等［24］方法。

1.3 统计方法 诱导出的愈伤组织，转移至分化培养基之前，进行胚性愈伤组织诱导率统计，分化培养结束后统计分化率。

胚性愈伤诱导率（%）=（胚性愈伤组织块数/愈伤组织总块数）×100。

分化率（%）=（分化的愈伤组织块数/接种在分化培养基上的愈伤组织块数）× 100。

胚性愈伤组织诱导率、分化率和草酸盐氧化酶活性采用Excel和SPSS 11.0进行统计分析

2 结果与分析

2.1 不同ABA对小麦幼胚组织培养特性的影响

通过在培养基中添加不同浓度ABA，分析其对幼胚组织培养的影响。结果表明，不同基因型间、ABA 浓度间胚性愈伤组织诱导率和分化率差异均达极显著水平。由此可见，ABA在幼胚离体培养中有重要的调控作用，同时品种间效应也存在显著差异。

2.2 不同基因型对小麦幼胚组织培养特性的影响

由表1可知，在试验条件下，基因型间胚性愈伤组织诱导率和分化率均达到极显著差异。诱导率以豫麦18最高，为74.2%；豫麦49次之，兰考906最低，豫麦18胚性诱导率分别是豫麦49和兰考906的1.24、1.41倍。分化率以豫麦18最高（72.1%），分别是豫麦49和兰考906的1.25和1.44倍；豫麦49次之（57.9%），兰考906最低。

2.3 ABA 浓度对小麦幼胚组织培养特性的影响

对不同浓度ABA诱导下幼胚胚性愈伤组织诱导率和分化率进行分析（表2），结果显示在试验的浓度范围内随ABA浓度的增加，3个品种胚性愈伤组织诱导率和分化率增加，之后由于浓度过高又下降，其中0.10  mg/L ABA胚性愈伤组织诱导率和分化率均较大。与不加ABA处理相比，0.05  mg/L浓度ABA处理均极显著增加豫麦18胚性愈伤组织诱导率和分化率，而对豫麦49和兰考906增加效应不显著；0.10和0.50 mg/L ABA处理均显著增加3个品种胚性愈伤组织诱导率和分化率，且差异均达到极显著水平，其中0.50较0.10  mg/L浓度的ABA效应降低，但差异不显著。从表2还可以看出，各浓度ABA培养下胚性愈伤组织诱导率和分化率排序均为豫麦18>豫麦49>兰考906。

2.4 ABA浓度对草酸盐氧化酶活性的影响 从表3可以看出，ABA浓度对不同基因型幼胚胚性愈伤组织草酸盐氧化酶活性均有显著影响，在试验的浓度范围内，随培养基中附加ABA浓度的提高，草酸盐氧化酶活性先提高，当达到一定浓度之后又下降。

从表3还可以看出，当附加0.10 mg/L ABA時，3个基因型幼胚胚性愈伤组织的草酸盐氧化酶活性均较高，且与其他浓度处理间均达极显著差异；没有附加ABA处理的草酸盐氧化酶活性最低，且与其他浓度处理间差异均达显著水平。豫麦49 附加0.05 mg/L ABA处理的草酸盐氧化酶活性小于附加0.50 mg/L ABA处理，而豫麦18和兰考906附加0.05  mg/L ABA处理大于附加0.50 mg/L ABA处理的草酸盐氧化酶活性。

相关分析表明，不同ABA浓度处理的草酸盐氧化酶活性与幼胚胚性愈伤组织诱导率间相关系数为0.961，相关性达极显著水平。

3 结论与讨论

于晓红等［9］研究发现，ABA对幼胚的胚性愈伤组织诱导有促进作用，在愈伤组织诱导培养过程中，加入适量的脱落酸有助于胚性愈伤组织的形成。该试验以适龄的幼胚为试验材料进行离体培养，结果表明0.10 mg/L ABA能改进愈伤组织的生长状态，获得较多质量高、致密的愈伤组织，有助于胚性愈伤组织的形成，从而提高分化率。当ABA浓度进一步提高时，愈伤组织质量反而有不同程度下降。关于ABA调节小麦幼胚愈伤组织培养特性的机理值得进一步研究。

有关小麦组织培养过程中草酸盐氧化酶活性及其调控的研究鲜有报道。该研究结果表明，小麦幼胚胚性愈伤组织草酸盐氧化酶活性受外源物质和基因型的影响，不同浓度ABA 对幼胚胚性愈伤组织草酸盐氧化酶活性有显著影响，并且随外源物质浓度的增加而增加，但浓度过量时反而会降低，以0.10 mg/L 浓度处理幼胚胚性愈伤组织草酸盐氧化酶活性最高，且品种间的效应也存在显著差异。小麦幼胚胚性愈伤组织诱导率与草酸盐氧化酶活性之间分析表明，二者之间极显著相关。Caliskan等［24-28］研究表明，草酸盐氧化酶是胚性愈伤组织形成过程中的关键酶。因此，加强组织培养过程草酸盐氧化酶的研究，通过外源物质的调控、基因型的选择等因素促进幼胚形成愈伤组织过程中草酸盐氧化酶基因的表达，将从生理机制上提高小麦幼胚体细胞再生的研究，促进组织培养技术在品种改良中的应用。

参考文献

［1］ VASIL V，SRIVASTAVA V，CASTILLO A M，et al.Rapid production of transgenic wheat plants by direct bombardment of cultured immature embryos［J］.Bio/Technology，1993，11（12）：1553-1558.

［2］ 葉兴国，徐惠君，赵乐莲，等.组织培养途径改良定型小麦品种的研究［J］.作物学报，1998，24（3）：310-314.

［3］ 高俊山，叶兴国，马传喜，等.不同组织培养途径对小麦再生能力的研究［J］.激光生物学报，2003，12（6）：406-411.

［4］ 尹钧，任江萍，宋丽，等.小麦不同转基因受体材料的植株再生培养研究［J］.麦类作物学报，2004，24（2）：1-4.

［5］ 黄璐，卫志明.不同基因型玉米的再生能力和胚性与非胚性愈伤组织DNA的差异［J］.植物生理学报，1999，25（4）：332-338，418.

［6］ 姬玉梅.离体培养下小麦幼胚愈伤组织诱导率与分化率的研究［J］.江苏农业科学，2010，38（5）：86-87.

［7］ 王晶晶，陈耀锋，张月琴，等.小麦幼胚愈伤组织分化和继代分化特性的影响因素［J］ .麦类作物学报，2015，35（6）：731-736.

［8］ 李宏潮，胡道芬，王虹.影响小麦成熟胚培养因素的研究［J］.华北农学报，1990，5（1）：22-27.

［9］ 于晓红，朱祯，付志明，等.提高小麦愈伤组织分化频率的因素［J］.植物生理学报，1999，25（4）：388-394，421.

［10］ 刘雷，尹钧，任江萍，等.基因枪轰击后大麦幼胚的组织培养及植株再生研究［J］.华北农学报，2003，18（4）：1-4.

［11］ 王常云，王作全，李晓亮，等.小麦幼胚离体培养育种技术研究［J］.麦类作物，1999（1）：14-16.

［12］ 刘少翔，王卉，孙毅，等.小麦幼胚的脱分化状态及再生性能研究［J］.华北农学报，2003，18（1）：64-67.

［13］ 梁竹青，高明尉，成雄鹰.供育种用的小麦未成熟胚离体培养技术研究［J］.作物学报，1988，14（2）：137-142.

［14］ 蔡体树，田慧琴，林书康，等.基因型和胚龄对小麦未成熟胚离体培养反应的影响［J］.遗传学报，1989，16（2）：81-88.

［15］ 曾寒冰.小麦未熟胚离体培养的研究：愈伤组织的诱导及再生植株［J］.东北农学院学报，1988，19（1）：1-9.

［16］ 章力健.小麦未成熟胚诱生大量绿苗的研究初报［J］.遗传学报，1987，14（3）：175-178.

［17］ 陈耀锋，王丽敏，丁云姣，等.Cu2+对小麦幼胚脱分化和高频再生特性的影响［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2004，32（10）：1-4.

［18］ 孙岩.提高小麦幼胚组织培养效果的初步研究［J］.黑龙江农业科学，2004（1）：25-27，32.

［19］ 杨金玲，桂耀林，郭仲琛.云杉属树种的体细胞胚胎发生［J］.植物学通报，1999，16（1）：59-66.

［20］ KAMADA H，HARADA H.Changes in the endogenous level and effects of abscisic acid during somatic embryogenesis of Daucus carota［J］.Plant and cell physiology，1981，22（8）：1423-1429.

［21］ 张栋，陈季楚．ABA、NAA诱导水稻胚性愈伤组织的研究［J］.实验生物学报，1995，28（3）：329-337.

［22］ 冯明芳，苍晶，卢秋巍，等．黑龙江粳稻再生体系建立的影响因素研究［J］.核农学报，2016，30（10）：1906-1913.

［23］ 王军虹，郑成成，于晶，等.冬小麦‘东农冬麦1号’成熟胚组织培养及再生体系建立［J］.东北农业大学学报，2015，46（11）：8-15.

［24］  CALISKAN M，TURET M，CUMING A C.Formation of wheat（Triticum aestivum L.） embryogenic callus involves peroxide－generating germin－like oxalate oxidase［J］.Planta，2004，219（1）：132-140.

［25］ LANE B G，DUNWELL J M，RAY J A，et al.Germin，a protein marker of early plant development，is an oxalate oxidase［J］.Journal of biological chemistry，1993，268（17）：12239-12242.

［26］  LANE B G，CUMING A C，FRGEAU J，et al.Germin isoforms are discrete temporal markers of wheat development.Pseudogermin is a uniquely thermostable water－soluble oligomeric protein in ungerminated embryos and like germin in germinated embryos，it is incorporated in to cell walls［J］.European journal of biochemistry，1992，209（3）：961-969.

［27］ LANE B G.Oxalate，germin，and the extracellular matrix of higher plants［J］.FASEB journal，1994，8（3）：294-301.

［28］ CALISKAN M，CUMING A C.Spatial specificity of H2O2－generating oxalate oxidase gene expression during wheat embryo germination［J］.The plant journal，1998，15（2）：165-171.

基金项目 河南省农业科学院基础性科研工作项目（2022JC01，2023JC01）;河南省农业科学院自主创新项目（2022ZC02）。

作者简介 何盛莲（ 1972—），女，河南商城人，研究员，硕士，从事小麦遗传育种研究。

收稿日期 2022-05-05