固氮菌Azotobacter salinestris 代谢物脂肪酸分析及其抗氧化活性研究

付振艳 排孜丽亚·帕尔哈提 宁慧霞 牛立涛 热合巴提·努尔夏提 排合尔丁·穆太力甫 阿布力米提·伊力

摘要  ［目的］探究固氮菌Azotobacter salinestris（As101）代谢物脂肪酸组成及抗氧化活性。［方法］采用气质联用法（GC/MS）进行脂肪酸组成分析；根据2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐 （ABTS）自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和羟基自由基清除能力测定抗氧化活性。［结果］固氮菌As101代谢物脂溶性成分中棕榈酸甲酯（11.34%）、邻苯二甲酸二丁酯（7.41%）、顺9，10-甲基十九烷酸甲酯（18.71%）、硬脂酸甲酯（3.08%）、12-甲基十四烷酸甲酯（8.02%）为主要成分，其次为油酸甲酯（5.01%）、（Z）-十六烯酸甲酯（3.44%）、14-甲基十六烷酸甲酯（1.67%）等。其中，不饱和脂肪酸达43.78%；固氮菌As101代谢物脂肪酸对DPPH自由基、ABTS自由基及羟基自由基的清除能力分别为53.05%、27.83%、43.77%。［结论］As101代谢物脂肪酸种类丰富，具有良好的开发利用价值及广阔的应用前景。

关键词  固氮菌；代谢物；脂肪酸；GC/MS；抗氧化活性

中图分类号  Q 939.11+3   文献标识码  A   文章编号  0517-6611（2023）05-0172-04

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2023.05.039

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Fatty Acid Analysis and Antioxidant Activity of Metabolites of Azotobacter salinestris

FU Zhen-yan1，Paziliya·Paerhati1，2，NING Hui-xia1 et al

（1.State Key Laboratory Basis of Xinjiang Indigenous Medicinal Plants Resource Utilization/Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Urumqi，Xinjiang 830011;2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039）

Abstract  ［Objective］The fatty acid composition and antioxidant activity of metabolites of Azotobacter salinestris （As101） were studied.［Method］The composition of fatty acids was analyzed by GC/MS;The antioxidant activity was determined according to the scavenging ability of 2，2-diazo-bis （3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid） diammonium salt （ABTS），1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine （DPPH） and hydroxyl radical.［Result］Palmitic acid （11.34%），phthalic acid （7.41%），cis-9，10-methyloctadecanoic acid （18.71%），stearic acid （3.08%），12 methyltetradecanoic acid （8.02%） were the main components of the fat soluble metabolites of Azotobacter As101，followed by oleic acid （5.01%），（z） -hexadecenic acid （1.44%），14 methylhexadecanoic acid （1.67%）.Among them，unsaturated fatty acids reached 43.78%;the scavenging abilities of fatty acids of metabolites of nitrogen fixing bacteria AS101 to DPPH radical，ABTS radical and hydroxyl radical were 53.05%，27.83% and 43.77% respectively.［Conclusion］As101 metabolites are rich in fatty acids，which have good development and utilization value and broad application prospects.

Key words  Azotobacter;Metabolite;Fatty acid;GC/MS;Antioxidant activity

脂肪酸是生物体的代谢产物成分之一，是其不可缺少的能量和营养物质。其中，饱和脂肪酸（SFA）对人体有提供能量、抑制肿瘤病毒生长等功能［1-3］，不饱和脂肪酸中的单不饱和脂肪酸（MUFA）具有降血糖、调节血脂和保护心血管［4］等作用，多不饱和脂肪酸（PUFA）具有维护神经细胞结构、预防心脑血管疾病和对抗肥胖等生理功能［5-8］。固氮菌是一种有机营养型细菌。菌体杆状、卵圆形或球形，能固定空气中的氮。氮是植物生长不可缺少的物质，是合成蛋白质的主要来源［9-10］。固氮菌擅长从空气中固定氮，它们能把空气中植物无法吸收的氮气转化成氮肥，源源不断地供给植物生长［11］。现代微生物学研究表明，细菌的细胞结构中普遍含有的脂肪酸成分与细菌的 DNA 具有高度同源性，不同种属的细菌，其脂肪酸的组成和含量表现出不同程度的差异，并且这种差异比较稳定，各种细菌具有其特征性的细胞脂肪酸指纹图谱［12］。截至目前，国内外對固氮类细菌代谢物脂肪酸成分研究的报道甚少，固氮类细菌代谢物脂肪酸缺乏系统研究。笔者运用GC/MS技术对固氮菌Azotobacter salinestris（As101）代谢物的脂肪酸成分进行系统性分析，并对其抗氧化活性进行评价，为挖掘固氮类细菌代谢物脂肪酸在医药及食品领域的潜在价值，以及为细菌指纹图谱分析与鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1    研究对象。新疆乌鲁木齐市盐湖景区（海拔1 009 m，地理坐标88.138 445 2°E、43.380 997 4°N）。

1.1.2    主要试剂。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（上海梯希爱化成工业发展有限公司）；2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）（北京索莱宝生物科技有限公司）；石油醚、甲苯、氢氧化钾、无水硫酸钠、无水乙醇、甘露醇、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸钙、酵母提取物、氯化铁、钼酸钠、葡萄糖、氯化钠、碳酸钙，均为国产分析纯。

1.1.3    培养基。Ashby培养基：葡萄糖10.0 g，磷酸二氢钾0.2 g，硫酸镁0.2 g，氯化钠0.2 g，硫酸钙0.2 g，碳酸钙5.0 g，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2，115 ℃，灭菌30 min；固氮培养基：甘露醇20.0 g，磷酸二氢钾0.2 g，磷酸氢二钾0.8 g，硫酸镁0.2 g，硫酸钙0.1 g， 酵母提取物0.5 g，氯化铁（微量），钼酸钠（微量），蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2，121 ℃，灭菌20 min。

1.1.4    仪器与设备。7890A-5975C 气质联用色谱仪（美国 Agilent 公司），恒温振荡培养箱（ZHWY-2102C），F-305 旋转蒸发仪（瑞士 BUCHI 公司），NICOLET 6700 红外光谱仪（美国 Thermo 公司），HH2 数显恒温水浴锅（郑州华峰仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1    土壤固氮菌As101的活化及發酵代谢物制备。试验用土壤固氮菌（Azotobacter salinestris，As101）是新疆特有药用资源利用省部共建重点实验室分离鉴定保存的菌株（Genbank登录号：OK445517）。从-80 ℃冰箱保藏菌株的甘油管中挑取1环固氮菌As101菌液，划线到Ashby固体培养基中，倒置37 ℃暗培养，2～3 d长出单克隆，挑取单克隆接到液体固氮培养基进行活化，温度33 ℃，转速160 min/r，培养时间48 h（对数生长期）；再以5%接种量接种于液体固氮培养基进行发酵，温度33 ℃，转速160 r/min，培养时间120 h，获得固氮菌As101发酵代谢物。

1.2.2    As101代谢物脂肪酸样品制备。经 “1.2.1” 中获得的固氮菌As101发酵代谢物，7 000 r/min离心10 min去除菌体，将上清液浓缩为原体积的1/3，以石油醚为提取溶剂，按1 ∶ 1比例与浓缩上清液混匀搅拌2 h，分液漏斗静置1 h，重复3次。收集3次的上层液，浓缩，40 ℃烘干24 h，称重，获得固氮菌 As101代谢物脂肪酸样品。

1.2.3    脂肪酸甲酯化。精确称取经 “1.2.2” 中制备的固氮菌 As101代谢物脂肪酸样品100 mg，溶解在石油醚和甲苯比例为1 ∶1的混合物（2 mL）中，加入2 mL 0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液，搅拌混匀，在室温下静置20 min，加入蒸馏水，使其静置分层。澄清后取上清液，用无水硫酸钠干燥，用微孔滤膜过滤后供GC-MS分析［13］。

1.2.4    GC-MS分析。甲酯化后的脂肪酸在配备有质谱检测器 （5975C配备安捷伦三轴检测器）的安捷伦7890 A 气相色谱仪上进行分析。操作条件如下：色谱柱（30 m×0.25 μm×0.25 μm），初始温度为50 ℃；以10 ℃/min加热至220 ℃，以5 ℃/min加热至250 ℃，最后以10 ℃/min加热至300 ℃，并保持10 min。载气为氦气，流速为1 mL/min，进样口温度为300 ℃，取样体积为0.2 μL，分流比为50 ∶1。电离方式为 EI；电离能量为 70 eV；离子源发生器温度为230 ℃；质量扫描范围为 40～500 m/z，全离子扫描。通过比较NIST库（NIST 08）获得质谱和标准质谱［13］。

1.2.5    抗氧化活性试验。

1.2.5.1    DPPH自由基清除试验。将100 μL各浓度的脂肪酸（0.17～5.76 mg/mL）和100 μL新配置的DPPH （0.2 mol/L） 加到96孔板上。然后立即混合，37 ℃避光反应 30 min，在波长 517 nm下测吸光度，并用以下公式计算抑制率。3次重复［13］。

DPPH自由基清除率=［1- Ai-Aj A0 ］×100%

式中，Ai为100 μL DPPH自由基溶液+100 μL样品的吸光度；A0为100 μL DPPH自由基溶液+100 μL石油醚的吸光度；Aj为100 μL样品+100 μL石油醚的吸光度。

1.2.5.2    ABTS自由基清除试验。将50 μL不同浓度脂肪酸（0.417 5～6.680 0 mg/mL）和150 μL ABTS自由基（吸光度在0.70±0.02）混合，在室温条件下反应10 min后，在730 nm处测定吸光度，并用上述公式计算抑制率。每个试验重复3次［13］。

1.2.5.3    羟基自由基（OH+）清除试验。分别取不同浓度脂肪酸（0.417 5～6.680 0 mg/mL）于试管中，各管加入800 μL硫酸亚铁（避光）6 mmol/L和800 μL水杨酸6 mmol/L，摇匀后各管加入0.1 % H2O2 50 μL混匀，37 ℃水浴30 min，以石油醚为空白对照，510 nm处测定各反应吸光度并按上述公式计算清除率［13］。

2 结果与分析

2.1 脂肪酸含量    固氮菌As101代谢物脂溶性成分提取量为3.6 mg/L。固氮菌As101代谢物脂肪酸甲脂总离子GC/MS流如图1所示，GC-MS结果经质谱数据库（NIST08）检索，与标准谱图进行比对分析，细菌As101代谢物脂溶性成分的脂肪酸组成按峰面积归一化计算各峰面积的质量分数，结果见表1。由表1可知，固氮菌As101代谢物脂溶性成分中顺9，10-甲基十九烷酸甲酯（18.71%）、棕榈酸甲酯（11.34%）、12-甲基十四烷酸甲酯（8.02%）、邻苯二甲酸二丁酯（7.41%）、油酸甲酯（5.01%）是主要成分。其中，不饱和脂肪酸达43.78%。

2.2  抗氧化活性    固氮菌As101代谢物脂肪酸提取物的抗氧化活性通過检测ABTS、DPPH自由基和羟基自由基清除能力进行评价。如图2所示，在检测浓度范围内，阳性对照VC和固氮菌As101代谢物脂溶性成分清除ABTS自由基能力均随浓度的增大而增强，表现出良好的剂量依赖关系。在检测浓度范围内，阳性对照VC的ABTS自由基清除率在70%以上，强于固氮菌As101代谢物脂溶性成分。对于固氮菌As101代谢物脂肪酸提取物，当浓度达到4.174 mg/mL时，ABTS清除率达到27.83%，表现出很强的清除ABTS自由基的活性。

从图3可见，固氮菌As101代谢物脂溶性成分和VC溶液对DPPH自由基的清除能力均与质量浓度呈正相关，且VC的清除能力高于固氮菌As101代谢物脂溶性成分。当固氮菌As101代谢物脂溶性成分浓度大于0.72 mg/mL时，清除率增长快速，当浓度达到5.76 mg/mL时，DPPH自由基清除率达到53.05%，表现出较好的清除活性。

羟基自由基去除能力是衡量天然化合物抗氧化活性的重要指标。如图4所示，固氮菌As101代谢物脂溶性成分和VC溶液对羟基自由基的清除活性均与质量浓度呈正相关，且VC的清除活性高于固氮菌As101代谢物脂溶性成分。固氮菌As101代谢物脂溶性成分呈现较好的羟基自由基清除能力；当浓度为4 mg/mL时，细菌As101代谢物脂溶性成分的还原能力为43.77%。

3 讨论与结论

该研究对新疆乌鲁木齐市盐湖景区土样中分离到的固氮菌代谢物脂溶性成分进行分析并进行了抗氧化活性研究。分析结果表明，在液体固氮培养基上，固氮菌As101在pH 7、温度33 ℃、转速160 r/min、发酵120 h条件下的代谢物脂溶性成分组分来看，不饱和脂肪酸顺9，10-甲基十九烷酸甲酯含量最高，其次依次为棕榈酸甲酯、12-甲基十四烷酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯。这与陈拾旸等［14］报道的双歧杆菌代谢产物脂肪酸构成，甘永琦等［15］报道的乳酶生菌种脂肪酸组分以及纪晓玲等［16］报道的1株四合木链格孢发酵产物的脂肪酸组分有很大的区别。大多数微生物代谢物中棕榈酸的含量相对高。陈拾旸等［14］的报道中饱和脂肪酸棕榈酸（C16：0）、硬脂酸（C18：0）、二十四烷酸（C24：0）为５株双歧杆菌代谢产物及细胞中的主要脂肪酸；纪晓玲等［16］的报道中四合木链格孢发酵产物的脂肪酸组分中不饱和脂肪酸占总脂肪酸的63.04%，其中油酸和亚麻酸的含量较高。出现这种差异的原因可能有2个方面： ①各报道中采用的菌株不同，不同种菌株之间脂肪酸存在差异;②细胞组成与生长阶段、培养基成分、温度等因素有关，作为细胞膜重要组成成分的脂类也会受到影响［17］。前者研究中使用的是双歧杆菌BS、MRS和马铃薯葡萄糖（PDA）3种培养基，而该试验中使用的是固氮培养基；另外，前者报道中的气质联用色谱分析条件也不同。细菌代谢物脂肪酸的组成受到很多因素的影响，因此在分析脂肪酸时，需要对培养基成分、培养条件、气相前处理条件等因素进行标准化，否则会影响测定结果的准确性和重复性。该研究含量最高的不饱和脂肪酸顺9，10-甲基十九烷酸甲酯相关报道甚少，有待更进一步研究。

健康的食品供应和有效的药物生产对人体免疫系统有直接影响。鉴于全球日益严峻的环境和健康挑战，找到不同的解决办法来改善食品供应和药品有效性，特别是找到具有高抗氧化活性的脂肪酸对药品生产和食品供应具有重要影响。鉴于此，笔者进行了固氮菌As101代谢物脂溶性成分抗氧化活性研究。脂肪酸成分抗氧化活性研究中，董强等［18］报道的鹰嘴豆脂肪酸中不饱和脂肪酸含量达87.79%～90.56%，脂肪酸DPPH自由基去除能力70%；赵海军等［19］报道，牡丹籽油脂肪酸成分中不饱和脂肪酸含量达80.55%～92.12%，脂肪酸DPPH自由基去除能力60.82%～95.68%。可以看出，不饱和脂肪酸含量越高，脂肪酸抗氧化活性就越高。虽然VC溶液对羟基自由基的清除活性均与质量浓度呈正相关，清除活性高于固氮菌As101代谢物脂溶性成分，但随浓度的升高，其变化趋势增加平缓，而固氮菌As101代谢物脂溶性成分清除自由基能力随浓度增加表现出“强拐点”，呈强线性特征，如固氮菌As101代谢物脂溶性成分清除DPPH自由基的能力可为今后挖掘高效抗氧化物质提供参考。

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