山羊ESR1·TENM1和THEM4多态性及其与繁殖性状相关性研究

时间：2024-05-22

李昆谕，刘玉芳，陶林，江炎庭，欧阳依娜，储明星*，

(1.云南省畜牧兽医科学院，云南昆明 650224；2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056001；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所/农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193)

产羔性状对于山羊的生产尤其重要，而提高单胎产羔数是提高产羔性状最主要的途径。山羊产羔数是一个极其复杂的性状，且产羔性状遗传力较低(约为0.1)，因此如何快速提高山羊产羔数是养羊业一个亟待解决的难题。与传统育种手段相比，分子遗传育种具有准确度高、可操作性强、育种成本低等优点，能更加高效、快速地对山羊产羔性状进行改良。利用分子标记技术有利于高繁殖力山羊的筛选，从而加快育种进程，可为山羊的选育工作提供更多便利[1]。ESR1(estrogen receptor 1)基因定位于9号染色体，拥有12个外显子。雌激素受体α由ESR1编码，通过与靶基因上的特异性效应元件结合，从而调节靶基因的表达[2]。雌激素受体α为雌激素的受体，与雌激素结合后，对胚胎、乳腺和雌性繁殖周期中卵泡的生长发育都发挥着重要作用[3]。研究表明，ESR基因是调控猪高产仔数的主效基因之一[4]。Tao等[5]通过GWAS、ROH 分析和选择特征检测发现ESR1是参与山羊卵巢功能的一个重要候选基因。TENM1和THEM4基因分别定位于山羊X号和3号染色体，分别拥有35个和6个外显子。Lai等[6]通过对奶山羊进行全基因组测序发现THEM4 在高繁殖力组中被特异性选择，TENM1 在低繁殖力组中被特异性选择。TENM1 属于Tenm/Odz基因家族。研究表明，Ten-M参与胚胎早期发育的调节，并在神经系统发育后期发挥作用[7-8]。

该研究所用候选基因来自实验室前期重测序数据，通过GWAS分析(显著性阈值为0.05)所得的在云上黑山羊(云上黑山羊是以云岭山羊为母本、努比山羊为父本培育而成的我国第一个肉用黑山羊品种[9-10])全基因组中的正选择基因(positively selected genes,PSG)。结合文献资料推测ESR1、TENM1和THEM4 可能对山羊繁殖性状有一定的影响，在前期数据中筛选出与产羔数相关的7个SNPs位点，其中ESR1为g.76097125C>T和g.76139051A>G位点，TENM1为g.17236451G>C、g.17333655C>T、g.17372494A>G和g.17586866T>C，THEM4为g.101275605G>A位点。采用 MassARRAY®SNP分型技术，在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊群体中对候选基因的基因型进行检测。MassARRAY®SNP分型技术是Agena公司推出的一个基因分析工具，通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF 质谱技术相结合，实现基因分型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高[11]。分型后分析其多态性与山羊繁殖性状的相关性，以期为山羊的高繁殖力分子标记辅助选择育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验样品试验用山羊饲养条件和生长环境一致，年龄2～5岁，共采集768只山羊(云上黑山羊544只、济宁青山羊133只、辽宁绒山羊91只)的血液。该试验将济宁青山羊视为高繁殖力群体，将辽宁绒山羊视为低繁殖力群体[9-10]。云上黑山羊有至少1胎产羔记录，部分有初生窝重和断奶窝重(3月龄)记录。所有山羊均采用颈静脉采血(10 mL/只)，使用EDTA-K2抗凝，-20 ℃下保存。试验山羊品种及其采样信息见表1。

表1 试验山羊品种及其采样信息Table 1 The breeds of test goats and their sampling information

1.2 血液DNA的提取使用酚氯仿法提取基因组DNA，采用Nano Drop2000检测DNA样本浓度，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

1.3 基因分型采用Sequenom MassARRAY®SNP分型技术对ESR1、TENM1和THEM4基因突变位点进行检测，相关引物信息见表2。

表2 引物序列Table 2 Sequences of the primers

1.4 数据统计与分析使用Microsoft Excel 2021软件统计山羊ESR1、TENM1和THEM4 突变位点的基因型频率、等位基因频率、多态信息含量(PIC)、杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)，并进行Hardy-Weinberg平衡检验。使用SPSS 25软件进行单因素方差分析，采用Tukey法进行多重比较，对山羊基因型与产羔表型数据进行相关性分析。试验数据均以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1ESR1 多态性分析利用Sequenom MassARRAY®SNP对768只山羊血液DNA进行基因分型。结果显示，ESR1 g.76097125C>T和g.76139051A>G位点在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊中存在多态性，其中g.76097125C>T位点基因型为CC、CT、TT型，g.76139051A>G位点基因型为AA、AG、GG型(图1)。

图1 ESR1 位点分型结果Fig.1 The locus typing results of ESR1 gene

统计济宁青山羊(高繁)和辽宁绒山羊(低繁)中ESR1 2个位点的基因型频率和基因频率，结果见表3～4。ESR1 g.76097125C>T位点的基因型频率和基因频率在高繁山羊和低繁山羊群体之间差异极显著(P<0.01)。g.76097125C>T位点在高繁群体和低繁群体的优势基因型为CC，优势等位基因为C；g.76139051A>G位点的基因型频率和基因频率在高繁山羊和低繁山羊群体之间差异不显著(P>0.05)。

表3 ESR1、TENM1和THEM4 7个多态位点在高繁、低繁山羊品种中的基因型频率

表4 ESR1、TENM1和THEM4 7个多态位点在高繁、低繁山羊品种中的基因频率

群体遗传学统计表明，ESR1 g.76097125C>T位点在济宁青山羊和辽宁绒山羊中为低度多态(PIC<0.25)，在云上黑山羊中为中度多态(0.25G在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊中为中度多态(0.25T位点在济宁青山羊中处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05)，在辽宁绒山羊和云上黑山羊中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)；g.76139051A>G在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊中均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)(表5)。

2.2TENM1基因多态性分析基因分型结果表明，TENM1 4个候选SNPs位点在3个群体中均存在多态性(图2)。如表3～4所示，TENM1 g.17372494A>G、g.17586866T>C位点的基因型频率和基因频率在高繁和低繁山羊群体之间差异显著(P<0.05)，但TENM1 g.17236451G>C和g.17333655C>T位点的基因型频率和基因频率在高繁和低繁山羊群体间差异不显著(P>0.05)。

图2 TENM1 位点分型结果Fig.2 The locus typing results of TENM1 gene

群体遗传学统计表明，TENM1 g.17333655C>T位点在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊中为低度多态(PIC<0.25)，TENM1基因其余位点多态性为0.01～0.36。卡方检验结果表明，TENM1 g.17236451 G>C和g.17586866 T>C位点在云上黑山羊和辽宁绒山羊中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)(表5)。

2.3THEM4 多态性分析基因分型结果表明，THEM4 g.101275605 G>A位点在3个群体中均存在多态性(图3)。如表3～4所示，THEM4 g.101275605 G>A位点的基因型频率和基因频率在高繁和低繁山羊群体之间差异均达到显著水平(P<0.05)，g.101275605 G>A位点在3个群体中只有GG和GA 2个基因型，其中GG为优势基因型，G为优势基因。

群体遗传学统计分析表明，THEM4 g.101275605 G>A位点在云上黑山羊、济宁青山羊、辽宁绒山羊中均为低度多态(PIC<0.25)。卡方检验结果表明，THEM4 g.101275605 G>A在云上黑山羊、济宁青山羊、辽宁绒山羊中均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)(表5)。

图3 THEM4 位点分型结果Fig.3 The locus typing results of THEM4 gene

2.4 候选SNPs位点与云上黑山羊繁殖性状的相关性分析由表6可知，ESR1 g.76097125C>T位点CT和TT型山羊的初生窝重显著高于CC型(P<0.05)；TENM1 g.17236451G>C位点GC型山羊的产羔数和断奶窝重显著高于GG型(P<0.05)；TENM1 g.17333655C>T位点CC型山羊的产羔数显著高于CT型(P<0.05)。其余SNPs位点多态性与云上黑山羊产羔数、初生窝重和断奶窝重之间无显著相关(P>0.05)。

表5 ESR1、TENM1和THEM4 7个多态位点在不同山羊品种中的群体遗传学分析Table 5 The population genetic analysis of 7 polymorphic sites of ESR1,TENM1 and THEM4 genes in different goat breeds

表6 ESR1、TENM1和THEM4 基因对云上黑山羊产羔性能的影响Table 6 Effects of ESR1,TENM1 and THEM4 genes on the lambing performance of Yunshang Black Goat

3 讨论

ESR1 编码的雌激素受体1与雌激素结合后，在雌性繁殖周期中卵泡的生长发育发挥着重要的作用。研究表明，ESR基因与小尾寒羊和湖羊的多羔性状密切相关[12-14]。刘欣[15]研究发现卵泡期成年母牛ESR1 在卵巢中表达量最高、在子宫中表达量最低。白淑等[16]使用免疫组织和荧光定量技术检测济宁青山羊出生后发育过程中雌激素受体在子宫的定位及表达，发现ESR1在子宫腔上皮、腺上皮、基质、血管内皮和平滑肌细胞胞核中均有表达，证实了ESR1参与调节子宫内膜与肌层的增殖和分化。将雌性小鼠的ESR基因敲除后，ESR缺陷雌性小鼠出现促黄体生成素调节紊乱、卵巢不排卵等现象，进而影响了小鼠的生育能力[17]。将ESR1 过表达可能导致卵泡闭锁[18]。总体来看，ESR1 可能对山羊的繁殖有一定的影响。该研究结果发现云上黑山羊群体中ESR1 g.76097125C>T位点TT型和CT型山羊的初生窝重高于CC型，因此推测该位点C>T突变可能对于云上黑山羊群体而言是一个优良的突变，可能会导致羔羊初生窝重增加。TENM1属于Tenm/Odz基因跨膜蛋白家族，目前关于TENM1 对山羊繁殖的影响研究较少。研究表明，TENM1 的缺失可能影响生殖系统的发育，在线虫中TENM1被证实是早期胚胎发生、生殖细胞发育、性腺迁移和表皮形态发生所必需的[19-20]。该研究结果表明，TENM1 g.17236451G>C和g.17333655C>T位点的多态性与云上黑山羊的产羔数显著相关，其中g.17236451G>C位点GC型山羊的产羔数比GG型高0.131，G>C的突变为有利于产羔的突变；g.17333655C>T位点CC型山羊产羔数比CT型高0.190，C>T的突变导致产羔数的下降，为不利的突变。综上所述，TENM1基因g.17236451G>C和g.17333655C>T位点可作为云上黑山羊产羔数选择的潜在分子标记。