基于转录组技术的枫叶鲑亲本鉴定和杂交优势分析

刘玉猛，蒋洁兰，毛明光*，朱诗裕，王 伟

(1.大连海洋大学海洋科技与环境学院，辽宁大连 116023；2.海南热带海洋学院崖州湾创新研究院，海南三亚 572024；3.海南热带海洋学院/海南热带海洋生物资源利用与保护教育部重点实验室，海南三亚 572022)

鲑鳟，是鲑鱼和鳟鱼的统称[1]。我国鲑鳟养殖是从20世纪60年代开始的，经历了60多年的发展，已经形成了一定的产业规模，并带来了巨大的经济效益[2]。随着国内需求的增加，养殖体量也不断增加，2018年我国第一个深海网箱建成并投入使用[3]，我国鲑鳟受精卵受制于欧洲，苗种是目前亟待解决的问题，优质的苗种可为下游养成打好基础和保障。

丹东华美渔业有限公司位于丹东市鸭绿江畔，该公司以鸭绿江为基地，从国外引种优质杂交鲑，并进行了推广养殖，是当地重要的创汇来源之一。其引进的杂交鲑优点明显，生长速度快，抗病力强，肉质优良，因肉色似枫叶的颜色，故名“枫叶鲑”。由于枫叶鲑属于外来物种，且商业品系的信息不全面，尤其是其遗传信息不明确，这为我国自主繁育造成了瓶颈，也对该地区物种来说是一种潜在的风险。

转录组测序技术已广泛应用于生物学领域[4-5]，但其在鱼类亲子鉴定方面鲜见报道。笔者利用Illumina高通量测序技术对枫叶鲑胸腺和头肾组织进行转录组测序，通过转录本拼接、基因功能注释，揭示枫叶鲑的基因表达特点，根据线粒体母源传递的特点，通过对转录组中线粒体基因比对分析，确定其母本来源，并根据免疫相关基因的转录探讨枫叶鲑抗病优势的原因，旨在为今后利用转录测序技术快速揭示未知来源物种的遗传信息提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料枫叶鲑由丹东华美渔业有限公司提供，为400 g。采样所需的手术剪、咬骨钳、镊子等器械均事先通过高压灭菌锅进行121 ℃，2 h 灭菌，采样前使用75%乙醇擦拭且经火焰消毒。将试验鱼解剖，分别取胸腺和头肾组织储存于10倍体积的 RNA later。

1.2 试验方法

1.2.1总RNA的提取及质量检测。利用RNA提取试剂盒提取枫叶鲑胸腺和头肾的总RNA。为了保证试验数据的高质量，将上述提取的RNA用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，紫外分光光度计检测其纯度与浓度。将检验合格的RNA用于构建cDNA文库。将上述cDNA文库利用Qubit DNA检测试剂盒对回收的DNA 精确定量，以方便按照1∶1 的比例等量混合后进行测序。

1.2.2文库质检和测序。将上述检验合格的cDNA文库在Illumina平台进行测序，首先过滤原始数据中低质量、末端质量低、含测序引物的reads，得到clean reads，然后再进行de novo拼接，最后通过CAP3软件拼接来获得最终Unigene序列集合[6]。cDNA 文库构建与测序由生工生物工程(上海)股份有限公司协助完成。

1.2.3转录组数据质控与组装。测序得到的原始数据中含有带接头的、低质量的序列[去除带N碱基的序列；去除reads中的接头序列；reads 3′—5′去除低质碱基(Q值<20)；reads 5′—3′去除低质碱基(Q值<20)；去除reads长度小于35 nt的reads及其配对reads]。为了保证信息分析质量，必须对原始数据过滤，得到Clean数据。

1.2.4基因功能注释和分类。利用BLAST软件[7]将Unigene序列分别与NR(NCBI non-redundant protein sequences)[7]、NT(NCBI non-redundant nucleic acid sequences)[7]、GO(Gene ontology)[7]、KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)[8]、KOG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)[9]、Uniprot(universal protein)[10]以及PFAM(protein family)[11]7个数据库进行比对分析，获得Unigene的注释信息，并对基因功能进行分类。获取枫叶鲑胸腺和头肾基因序列与近缘物种基因序列的相似性以及枫叶鲑胸腺和头肾基因的功能信息，并按照分子功能、细胞组分和生物过程3个大类对其进行GO功能分类。此外，还进行了KOG功能分类，同时获得 KEGG代谢通路分析结果。

1.2.5基于转录组测序的枫叶鲑亲本鉴定和杂种抗病优势分析。通过对转录组测序结果数据进行筛选以及利用BLAST软件进行比对分析，将筛选得到的线粒体DNA(mtDNA)基因序列和基因组基因序列在NCBI数据库中进行比对，分别确定枫叶鲑的母本及父本来源。将筛得到的免疫相关基因序列进行比对分析，探讨枫叶鲑所具有的抗病优势来源。

2 结果与分析

2.1 样本原始数据统计及数据质控采用双端测序法并经过质量控制后[12]，共获得胸腺的7.29 Gb总碱基数，GC含量为 47.73%，Q30碱基比例平均超过95.33%；共获得头肾的6.30 Gb 总碱基数，GC含量为 48.63%，Q30碱基比例平均超过95.12%。

2.2 转录组拼接结果统计对测序结果进行组装、拼接[12]，结果表明，胸腺样本共得到358 880条Transcript和169 204条Unigene，Transcript与Unigene的N50分别为1 463和896 bp；头肾样本共得到282 289条Transcript和132 292条Unigene，Transcript与Unigene的N50分别为1 491和918 bp，表明组装完整性较高。

2.3 基因注释将枫叶鲑胸腺和头肾转录组测序筛选所得的Unigene序列与数据库进行比对和注释。依据各数据库注释的Unigene序列数量和比例可知，各数据库由于筛选条件不同，成功注释的基因数也不同。胸腺和头肾基因中以NT数据库成功注释的Unigene序列最多，胸腺基因达116 178条，占68.66%；头肾基因达92 700条，占70.07%，这与其采用序列相似性比对搜索有关。KEGG数据库注释的信息最少，胸腺基因仅有3 451条，占2.04%；头肾基因仅有3 203条，占2.42%。

2.4 NR库比对注释通过与NR库的比对，结果见图1。从图1可见物种转录本序列与相近物种的近似情况，以及同源序列的功能信息。在所有注释成功的 Unigene 中，与 NR库比对的物种相比，枫叶鲑与虹鳟(Oncorhynchusmykiss)的基因相似度最高，其次是大西洋鲑鱼(Salmosalar)，胸腺分别达32 360条(50.48%)和25 492条(39.77%)，头肾分别达25 721条(49.90%)和20 920条(40.59%)。

注：A为胸腺，B为头肾。 Note:A is thymus,B is head kidney.图1 NR库比对注释Fig.1 NR database comparison note

2.5 功能分类注释通过GO数据库比对注释，结果如图2、3所示，胸腺中共得到50 027条注释基因，约占总Unigene的29.57%；头肾中共得到40 853条注释基因，约占总Unigene的30.88%。GO数据库将注释基因总共分为三大类别，分别为分子功能(molecular function)、生物过程(biological process)和细胞组分(cellular component)。胸腺和头肾基因中生物过程(biological process)占比最多的是细胞过程(cellular process)，分别为33 722条(67.51%)和27 959(68.44%)；细胞组分(cellular component)占比最多的是细胞(Cell)，分别为34 404(68.77%)和28 662(70.16%)；分子功能(molecular function)占比最多的是结合活性(binding)，分别为31 739(63.44%)和26 151(64.01%)。

胸腺和头肾基因中分别有22 962条和19 648条Unigenes在KOG数据库中成功进行功能注释，合计25类。其中数量最多的是信号转导机制(signal transduction mechanisms)，胸腺有5 044条(21.97%)，头肾有4 072条(20.72%)。

胸腺和头肾KEGG通路富集分类中分别有5 275和4 820个差异表达基因参与到四大类23小类代谢通路中。注释基因最多的3个通路首先是信号转导通路(signal transduction pathway)，其次是运输和分解代谢通路(transport and catabolism pathway)，排第3位的通路在胸腺和头肾中分别为细胞群落通路(cellular community pathway)和折叠分类和降解通路(folding sorting and degradation pathway)。

图2 GO注释上的胸腺基因功能分类Fig.2 The functional classification of thymus genes on GO annotation

图3 GO注释上的头肾基因功能分类Fig.3 The functional classification of head and kidney genes on GO annotation

2.6 枫叶鲑mtDNA及基因组信息分析将胸腺和头肾Unigene序列中与mtDNA相关的基因和基因组基因进行筛选，分别筛选出与mtDNA相关基因序列和基因组基因序列，再利用Blast软件进行比对分析，比对结果见表1、2。通过mtDNA基因序列包含12S rRNA、16S rRNA、28S rRNA、细胞色素b(Cytochrome b,Cyt b)和细胞色素c氧化酶(Cytochrome c oxidase)在内的基因序列比对结果以及根据mtDNA具有的母系遗传特点[13-14]，可以初步判断枫叶鲑的母本为虹鳟(Oncorhynchusmykiss)(表1)。

通过比对基因组基因序列包含E3泛素蛋白连接酶(E3 ubiquitin-protein ligase,E3)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)、T细胞表面抗原CD2(T-cell surface antigen CD2,CD2)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、不依赖阳离子的甘露糖-6-磷酸受体(Cation-independent mannose-6-phosphate receptor,CI-MPR)、细胞因子诱导型含SH2蛋白(Cytokine-inducible SH2-containing protein,CISH)、肌生成调节糖苷酶(Myogenesis-regulating glycosidase,MYORG)结果可知，在大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchustshawytscha)、红大麻哈鱼(Oncorhynchusnerka)、银大麻哈鱼(Oncorhynchuskisutch)和大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)4种鱼的基因序列比对中，基因组基因序列的同源性和大鳞大麻哈鱼最高，因此初步判断父本为大鳞大麻哈鱼。

表1 线粒体基因序列比对结果Table 1 Results of mitochondrial gene sequence alignment

表2 基因组基因序列比对结果Table 2 Genomic gene sequence alignment results

2.7 枫叶鲑抗病优势基因将胸腺和头肾Unigene序列中与免疫相关的基因进行筛选，再利用BLAST在线分析软件对免疫球蛋白M(Immunoglobulin M,IgM)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、T淋巴细胞相关基因(T lymphocyte related genes)和B淋巴细胞相关基因(B lymphocyte related genes)的基因序列进行比对分析，比对结果见表3。根据序列比对结果，推测杂交优质品种枫叶鲑所具有的抗病优势是遗传其亲本虹鳟而来。

表3 免疫相关基因序列比对结果Table 3 Sequence alignment results of immune-related gene

3 讨论与结论

3.1 枫叶鲑胸腺和头肾无参转录组的组装与注释该研究对枫叶鲑进行了转录组分析，并结合转录组信息作出了亲本鉴定和杂种优势相应的数据分析。为了获取枫叶鲑转录组信息，在未参照基因组的情况下对其胸腺、头肾这2种组织转录组进行了高通量转录组测序，对数据进行过滤和质控后，采用Trinity软件[15]组装、拼接和转录本功能注释，共得到13.59 Gb的转录组clean data信息，Q30碱基比例均超过95%。从转录组质量来看，测序数据的各项指标测序质量较高，达到后续数据组装分析的要求。

该研究分别对枫叶鲑胸腺和头肾组织转录组文库组装的169 204条Unigene和132 292条Unigene进行了GO功能分类、KOG功能分类和KEGG代谢通路等分析。通过GO数据库比对注释，胸腺Unigene注释比例较头肾少1.31百分点。在KOG数据库中成功进行功能注释的胸腺和头肾Unigene序列，其中数量最多的是信号转导机制，胸腺Unigene注释比例较头肾多1.25百分点。通过KEGG代谢通路分析得到的胸腺Unigene注释比例较头肾少1.13百分点。该研究通过功能分类注释获得了大量的枫鲑胸腺和头肾组织转录组信息，并且初步阐明枫鲑胸腺和头肾组织相关的基因功能以及生物学过程、代谢途径和信号传导途径。这对将来深入了解枫叶鲑基因功能至关重要，并为发掘枫叶鲑相关功能基因和研究相关生理功能提供基础数据。

3.2 利用线粒体基因与基因组基因信息判断枫叶鲑的遗传背景线粒体是具有自身基因组的细胞内细胞器，现已被证明至少有4种表观遗传机制：①调节核基因组表达的表观遗传机制通过调节核编码线粒体基因的表达来影响线粒体；②核基因的甲基化模式由细胞特异性mtDNA含量和线粒体活性决定;③核基因表达模式和核DNA甲基化水平受mtDNA变异影响;④mtDNA也被表观遗传修饰[16]。表观遗传修饰往往在不改变DNA序列的情况下引起基因表达的改变，包括DNA甲基化、非编码RNA活性、组蛋白修饰和染色质重塑等[17-18]。作为一种常见的表观遗传现象，DNA甲基化可以改变DNA构象或染色质结构，以及DNA的稳定性，DNA与蛋白质相互作用的方式，并最终调节基因的表达[19-21]。动物mtDNA几乎完全遗传其母系而来，父本线粒体在受精过程中迅速降解[22]或在此后的复制过程中缺失[23]。 最新研究结果倾向于支持“瓶颈假说”，即mtDNA的母系遗传是由上一代基因型的少数特殊种系mtDNA分子的差异扩增介导的[24]。在现有的用于系统发育研究的基因中，Cyt b的结构和功能在mtDNA上是较为清楚的，也是常用于进行物种分类鉴定的基因[25]。基于线粒体表观遗传受多种机制调控及DNA甲基化修饰调节机体基因表达等特点，再结合mtDNA母系遗传的特点，该研究对枫叶鲑的转录组信息进行处理分析，将筛选得到的mtDNA基因序列及基因组基因序列进行比对分析，最终初步得出虹鳟是母本，大鳞大麻哈鱼是父本的结论。比对结果中发现，有的基因组基因如肌生成调节糖苷酶与银大麻哈鱼的同源性也达到100%，这可能由枫叶鲑商业化生产中父本的来源不确定造成，因此对于父本鉴定的准确性仍有待进一步完善。

3.3 杂交鲑抗病优势杂交育种在水产动物的品种改良和生产中发挥了重要作用。该方法利用孟德尔遗传定律，如分离和自由组合定律及连锁互换定律，重新构建生物体的遗传力，创造出理想的变异体[26]。杂交育种不产生新的基因，而是将现有生物资源的基因和性状进行重组，将分散在不同群体中的基因组合起来，建立符合人们意愿的基因型和表型[26-27]。而杂种优势是自然界普遍存在的生物现象，是指杂种后代在多个性状(品质、产量、适应性、抗逆性、繁殖能力和生长优势等)上超越亲本的现象[28-30]。该研究中的枫叶鲑则是具有优良抗病性状的杂交鲑，对其抗病优势的遗传信息进行分析能更好地为其他水产动物的杂交育种奠定基础。

硬骨鱼类的IgM为四聚体免疫球蛋白，在鱼类的体液免疫中发挥着重要作用[31]，并对各种抗原产生有效的特异性体液抗体反应。IgM是B淋巴细胞最早产生的免疫球蛋白分子,也是B淋巴细胞分化过程中的主要表面标志[32]。细胞因子在免疫系统的调节反应中起着至关重要的作用。研究发现，细胞因子在调节和控制免疫反应的分子进化过程中是高度保守的[33]。TNF-α是细胞因子家族的重要成员之一，是导致细胞凋亡和抵抗细胞内病原体的重要因素，是一种重要的抗癌因子[34]。除了引起肿瘤细胞出血性坏死而凋亡外，它还可以介导炎症和调节免疫功能[34-35]。综合IgM和TNF-α在鱼类机体免疫调节过程中所起到的重要作用，该研究筛选出了枫叶鲑转录组信息中的IgM、TNF-α基因序列和T、B淋巴细胞相关基因序列，并进行了物种同源性比较。

该研究在探讨了枫叶鲑品种的亲本分别是虹鳟(母本)和大鳞大麻哈鱼(父本)之后，对其抗病优势进行分析，尽管该研究所列出的免疫相关基因序列与母本虹鳟的同源性更高，但根据杂交所产生的基因、性状重组以及杂交子代会出现的杂种优势，又因为枫叶鲑在商业化生产过程中父本的来源具有不确定性，因此，初步判断枫叶鲑所具有的杂种抗病优势是由其亲本双方的抗病优势基因的基因重组所产生的结果。

该研究应用Illumina高通量测序技术对枫叶鲑遗传信息进行了探讨，可以快速判断父、母本的来源，并获得大量遗传信息，具有较好的应用前景，后续也可为其他水产养殖动物的亲本鉴定和杂种优势分析提供科学依据。