羊肉中貉源成分Real-time PCR检测方法的建立

张 谊，汤思凝，梅汝蕃，郝立武，张书宏，王秋悦，郑百芹*

(1.唐山市食品药品综合检验检测中心，河北唐山 063000；2.河北科技师范学院动物科技学院，河北秦皇岛 066000)

我国是羊肉产量大国，羊肉消费呈逐年增长的趋势，但掺假问题一直是影响羊肉消费的关键问题，尤其是动物源性食品掺假是最常见也是最难鉴别的严重问题[1-2]。我国毛皮经济动物貉子养殖量大，每年会产出大量的貉子废弃肉，貉子胴体有可能成为羊肉掺假中一类。截至目前，已经开发了许多肉类掺假检测的检测技术，包括Real-time PCR(qPCR)检测技术、近红外特征光谱技术、高光谱法、分光光度法和酶联免疫分析法等[3-12]。这些检测方法中，Real-time PCR特异性更强、灵敏度更高、成本更低，该方法在肉类掺假方面的应用已日趋成熟[13-18]。该研究利用Real-time PCR，建立一种对貉肉源成分的快速检测方法，以期对羊肉及其肉制品中貉肉源的掺假进行定性及定量的检测，为量化羊肉成分研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料猪肉、牛肉、鸡肉、鸭肉购自秦皇岛某大型超市；羊肉、貉肉、狐狸肉、貂肉由河北省预防兽医重点实验室提供；吸附柱法动物组织基因组DNA提取试剂盒、磁珠法动物组织基因组DNA提取试剂盒购自北京天根科技有限公司；琼脂糖、DL2000 DNA Marker、2×ESTaqMasterMix(Dye)均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备NanoDrop 2000核酸蛋白定量仪(美国Thermo Scientific公司)；DYY-6D型电泳仪(北京市六一仪器厂)；高速离心机 FC5515R(上海京工实业有限公司)；台式高速离心机 TGL-16G(上海安亭科学仪器厂)；Mx3000P Agilent(美国安捷伦Stratagene公司)。

1.3 试验方法

1.3.1样品的制备。分别取猪、牛、羊、鸡、鸭、狐狸、貉、貂8种动物的鲜肉组织样本各1 g，放在高压灭菌处理过的研钵中进行液氮研磨，研成肉末后转移至冻存管中，于-80 ℃保存备用。

1.3.2基因组DNA的提取。分别称取100 mg 8种动物组织肉末，按组织基因组DNA提取试剂盒操作说明提取DNA，-20 ℃保存备用。

1.3.3DNA浓度纯度检测。用NanoDrop 2000核酸蛋白定量仪测定核酸浓度与纯度，记录A260/A280及A260/A230值；并将DNA进行2%琼脂糖凝胶电泳，以检测其完整性。

1.3.4PCR引物设计。参考相关文献[19-23]，根据貉子线粒体cytB基因序列，并使用NCBI Blast、MEGA 7等软件将貉源cytB基因与猪、牛、羊、鸡、鸭、狐狸、貂物种序列进行比对，筛选不同种物种间差异序列，设计特异性引物。选择较为保守的基因16S rDNA为内参基因，设计通用引物。引物序列如表1所示。

1.3.5实时荧光 PCR反应条件的建立与优化。实时荧光PCR反应体系(20 μL)：上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，2×Perfect StartTMGreen qPCR SuperMix 10.0 μL，Nuclease-free Water 8.2 μL，模板DNA 1.0 μL。预试验中在46～54 ℃设置了梯度PCR，最后确定了50 ℃为退火温度，其扩增效果最佳。PCR反应条件：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。

表1 特异性引物和通用引物序列Table 1 Specific primer and universal primer

1.3.6特异性引物和通用性引物检测。将提取8个物种基因组DNA进行稀释，浓度均为50 ng/μL，分别使用特异性引物cytB及通用引物16S rDNA进行qPCR扩增，ddH2O为阴性对照。根据所得曲线图及Ct值分析cytB引物的特异性和16S引物通用性。

1.3.7引物灵敏度检测。将初始浓度为50 ng/μL的貉DNA样本进行5倍梯度稀释，使其终浓度分别为50.0 ng/μL、10.0 ng/μL、2.0 ng/μL、400.0 pg/μL、80.0 pg/μL、16.0 pg/μL、3.2 pg/μL，分别以其为模板进行qPCR扩增，ddH2O为阴性对照。根据曲线图及Ct值分析特异性cytB引物所能扩增的最低检测浓度。

1.3.9标准曲线准确性验证。以总质量为100 mg，貉肉含量分别为5%、15%、45%、65%和95%的貉羊混合肉进行DNA提取后，统一稀释为50.0 ng/μL，进行qPCR扩增。将ΔCt值带入已建立的定量标准曲线，计算羊肉质量百分比及其回收率，16S rDNA作为内参，每个样品做3个重复，检验标准曲线的准确性。

1.3.10检测方法的稳定性评估。取终浓度分别为400.0、80.0、3.2 pg/μL的貉DNA样本，以其为模板进行qPCR扩增，分别进行组内及组间重复性试验。每个浓度重复检测3次，记录各浓度在检测体系的Ct值，并计算其变异系数，以评估检测方法的稳定性和重复性。

2 结果与分析

2.1 DNA浓度和纯度测定不同肉类DNA浓度和纯度测定结果见表2。按核酸提取要求，无蛋白质污染的核酸溶液A260/A280>1.8，无碳水化合物污染的核酸溶液A260/A230>2.0。测定结果(表2)显示，提取的各类肉DNA纯度和浓度均达到要求，模板DNA质量较好，无蛋白及杂质污染，可用于后续qPCR检测。

表2 DNA浓度和纯度测定结果Table 2 Determination results of DNA concentration and purity

不同肉类基因组DNA电泳检测结果如图1所示。电泳条带清晰、完整，说明提取的基因组DNA可用于后续qPCR检测。

注：M为mark。图1 各种肉类基因组DNA提取结果电泳图Fig.1 Electrophoretogram of genomic DNA extraction results of various meats

2.2 引物cytB特异性及16S通用性检测结果以cytB作为特异性引物，分别以猪、牛、羊、鸡、鸭、貉、狐狸和貂基因组DNA为模板进行qPCR扩增。如图2所示，8种畜禽肉中，只有貉肉DNA在第17个循环处开始进入指数扩增期，而其余6种在第27个循环处才开始进入指数扩增期，可以很好地与其他几个常见物种区分，表明cytB引物特异性较强，符合试验要求。

图2 特异引物cytB对不同肉类DNA的扩增曲线Fig.2 Amplification curves of specific primer cytB on different meat DNA

内参引物16S对8种畜禽肉均有较好的扩增效率，且内参基因16S rDNA 检测的Ct值均集中在狭窄范围内，较为稳定(图3)，表明其具有通用性。

图3 内参引物16S对不同物种肉DNA的扩增曲线Fig.3 Amplification curve of meat DNA of different species by internal reference primer 16S

图4分别为特异性引物和通用引物的扩增熔解曲线，特异性引物扩增熔解曲线峰值温度为85.65 ℃，通用引物峰值温度为84.25 ℃，2个熔解曲线均为规则特异性单峰，无杂峰，说明试验所用2个引物均无二聚体产生且特异性较强，符合检测要求。

2.3 引物灵敏度检测以不同浓度貉基因组DNA为模板进行qPCR检测判断其最低检测限，结果如图5所示。当模板浓度为0.64 pg/μL时，cytB引物扩增曲线与阴性对照无酶水扩增曲线不能明确区分；而当模板浓度为3.2 pg/μL时，特异引物指数扩增曲线可与其他浓度曲线准确明显区分，因此该引物的最低检测限为3.2 pg/μL。

2.4 标准曲线建立不同比例貉羊混合肉样实时荧光定量结果如表3所示。每个样品做3个重复。以貉子肉质量百分比的log10值为横坐标、ΔCt为纵坐标绘制标准曲线(图6)，得出回归方程为Y=-4.212X-0.636 4(R2=0.988 9)，且扩增效率(E)为97.86%，符合《实时荧光定量国际化标准-MIQE指南》中E<105%的标准，表明建立的标准曲线具有良好的线性关系，满足实时荧光定量国际化标准的要求。

图4 特异性引物(a)和通用引物(b)扩增熔解曲线Fig.4 Melting curve of amplification with specific primers (a) and universal primers(b)

图5 引物cytB对不同浓度DNA的扩增曲线Fig.5 Amplification curves of primer cytB on DNA gradients of different concentrations

2.5 标准曲线准确性验证分别以质量比为5%、15%、45%、65%、95%的貉羊混合肉样为模板，进行qPCR检测，Ct值结果如表4所示。将ΔCt值代入标准曲线Y=-4.212X-0.636 4，计算出貉肉的含量及其回收率，由表4可知其回收率为97.71%～104.36%。试验结果符合要求，具有实践意义。

2.6 检测方法的稳定性评估为了检测该方法稳定性，该研究分别做了组内及组间重复各3组，每组3个重复。重复性检测结果见表5，组内变异系数为0.13%～0.59%，组间变异系数为0.04%～1.08%，表明检测方法具有较好的稳定性。

表3 不同质量百分比貉肉Ct以及ΔCt值检测结果Table 3 Test results of raccoon dog meat mass percentage Ct and ΔCt values

3 讨论与结论

肉类掺假中最常见的手段是使用废弃肉或低品质的肉类替代高品质昂贵的肉类，我国貉养殖量巨大，每年都会产生大量的貉废弃肉，这些肉往往容易被掺入到价格更高的羊肉中去，因此对羊肉中掺入貉源成分的检测方法的开发尤为重要。该试验为检测羊肉中貉源成分的含量，建立Real-time PCR的方法，以cytB基因为特异性检测引物，构建了标准定量曲线，检测结果表明在模拟掺假肉中样品回收率为97.71%～104.36%，最低检测限达3.2 pg/μL。董洋洋[24]通过实时荧光PCR法对牛肉中的鸭肉和猪肉成分进行了鉴定，其检测限分别达0.20 和0.02 ng。姜洁等[25]对羊肉中猪源成分和鸡源成分进行定量检测，结果显示其质量检测百分比的绝对误差可以控制在7%以内。薛晨玉等[26]对羊肉中鸡源成分的量化检测发现，检测百分比与理论百分比间的绝对误差在5%以内。该研究所建立的方法抗干扰能力较强，可有效地检测出羊肉中的貉源成分，量化研究结果准确。

图6 混合貉肉含量ΔCt标准曲线Fig.6 Mixed raccoon dog meat content ΔCt standard curve

由于羊肉制品在加工过程中其DNA质量会受到不同程度的损耗，因此选择一种高质量的核酸DNA提取方法至关重要。在试验过程中分别采用常见组织DNA提取方法，包括试剂盒吸附柱法、试剂盒磁珠法、SDS法、氯仿-醋酸钠法、苯酚-氯仿抽提法。通过对提取DNA的完整性、浓度、纯度、试验耗时、耗材等方面比较得出，试剂盒法更适合用于常见动物源性肌肉DNA的提取。相比较试剂盒吸附柱法和试剂盒磁珠法，前者提取的核酸浓度高，糖类杂质少，DNA提取率更高。

表4 模拟混合肉样Ct值检测结果Table 4 Ct value of simulated mixed meat sample

表5 组内和组间重复性试验结果Table 5 Repetitive experimental results within and between groups

该研究拓展了羊肉中动物源性成分检测的应用，实现了在基因水平对貉肉成分的量化判定，为羊肉掺假工作的检验奠定了基础。今后将进一步研究羊肉掺假中多种肉源成分鉴定的方法，为羊肉制品掺假的检测提供更为简单、快捷、准确的技术手段和执法依据，以满足市场需求。