不同产地甘草药材质量评价

陈玉娥，冯 冲，杨诗慧，刘奇越，刘尉棋，杜远远，马恩耀*，周劲松

(1.广州采芝林药业有限公司，广东广州 510006；2.广东汉潮中药科技有限公司，广东广州 510006)

甘草为豆科植物甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)、胀果甘草(GlycyrrhizainflataBat.)或光果甘草(GlycyrrhizaglabraL.)的干燥根和根茎，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效，可用于治疗脾胃虚弱、倦怠乏力、心悸气短、咳嗽痰多、脘腹和四肢挛急疼痛、痈肿疮毒等病症，并缓解药物毒性、烈性[1]。作为药食同源的中药材大品种，甘草具有两千多年的药用历史。甘草始载于《神农本草经辑注》[2]，“一名美草，一名密甘”，因其“调和众药有功”又名“国老”[3-4]。研究发现，甘草主要含有三萜类、黄酮类、多糖类、香豆素类等活性成分，具有抗肿瘤[5]、抗菌[6]、调节免疫[7-8]、抗纤维化[9-10]、保护神经[11]、保肝降糖[12-14]等药理活性[15]。另外，四逆散传统汤剂、复方颗粒剂、配方颗粒剂中均含有不同含量的甘草酸和甘草苷[16]。甘草主要产于内蒙古自治区、甘肃省、宁夏回族自治区、新疆维吾尔自治区等地。作为大宗品种之一，甘草不仅可以作为药用，其还可以应用于食品、化妆品、烟草等领域。因此，甘草的需求量日益增加，野生甘草供不应求，栽培甘草逐渐占领市场成为甘草的主要货源。

在中药产业源头的种植基地，中药材属农副产品，经药材市场或生产加工才被称为中药。对药农而言，种植的中药是一种农副产品，大多数仅看到眼前的经济效益，不会认为这是用于治病救人的中药而严格把控种植的各个环节，农药、化肥的过度使用，不合理的大规模种植栽培伴随着连种障碍和土地污染，造成中药材普遍存在质量不达标、农药残留或重金属超标现象[17]。目前中药材质量评价常用的方法有逐步判别分析法、熵权TOPSIS法、R型聚类分析法等。逐步判别法是利用检验方法对变量进行逐步筛选，找出显著性变量并剔除不显著变量，同时进行判别的一种方法；熵权TOPSIS法是依据分析对象与理想化目标的接近程度进行顺序优选的一种多指标决策分析方法，可将多个指标综合成一个指标进行分析，降低了因指标因素不足而导致的数据欠准确性，具有较高的科学性；R型聚类分析是对变量进行分类处理的一种方法，可呈现个别变量之间、各个变量组合之间的关系的亲疏程度。因此，该试验采集了不同产地甘草样品，以2020年版《中国药典》为依据，对甘草样品进行水分、总灰分、酸不溶性灰分、重金属、甘草苷和甘草酸含量的检测，并通过逐步判别分析法、熵权TOPSIS法、R型聚类分析法研究不同产地的甘草，探索适用于不同产地甘草的统计分析方法，最终实现对不同产地的甘草进行质量评价。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1仪器。万分之一天平(AP225WD，日本岛津公司)；百万分之一微量分析天平(XBR36，梅特勒-托利多精密仪器有限公司)；数显恒温水浴锅(J-HH-6A，上海胜卫电子科技有限公司)；数显鼓风恒温干燥箱(GZX-9070，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；箱式电阻炉(SX2-4-10Z，上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；微波消解仪(Multiwave Pro，安东帕中国有限公司)；电感耦合等离子质谱仪(7800，安捷伦科技有限公司)；高效液相色谱仪(UltiMate3000，赛默飞世尔科技有限公司)。

1.1.2试剂。铅(CDJS-GSB04-1742-2004，50 mL)、镉(CDJS-GSB04-1721-2004，50 mL)、砷(CDJS-GSB04-1714-2004，50 mL)、汞(CDJS-GSB04-1729-2004，50 mL)、铜(CDJS-GSB04-1725-2004，50 mL)，均出自国家有色金属及电子材料分析测试中心；甘草苷对照品(111610，中国食品药品检定研究院)；甘草酸铵对照品(110731，中国食品药品检定研究院)。

1.1.3试材。该试验收集了2个省份4个不同产区的甘草药材及饮片，并根据产地对样品进行了分组和编号(表1)。

表1 甘草样品信息Table 1 Sample information of Glycyrrhiza uralensis

1.2 试验方法

1.2.1高效液相色谱法测定甘草苷和甘草酸。

1.2.1.1色谱条件。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，利用流动相乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)进行梯度洗脱(0～8 min，19% A；8～35 min，19%～50% A；35～36 min，50%～100% A；36～40 min，100%～19% A)，其检测波长为237 nm；进样量10 μL；理论板数按甘草苷峰计算应不低于5 000。

1.2.1.2对照品溶液的制备。取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%乙醇分别制成每l mL含甘草苷20 μg、甘草酸铵0.2 mg的溶液，其中，甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.020 7。

1.2.1.3供试品溶液的制备。取甘草药材粉末(过3号筛)约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.2中药材质量评价方法。运用软件SPSS 23.0中的逐步判别分析法、熵权TOPSIS法、R型聚类分析法对4个产区甘草样品的各项检测指标进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 水分、总灰分、酸不溶性灰分的检测按2020年版《中国药典》(四部)水分测定法(通则0832第二法)、灰分测定法(通则2302)项下总灰分及酸不溶性灰分测定法分别对水分、总灰分、酸不溶性灰分进行测定。按照质量标准甘草按干燥品计算，其水分不得超过12.0%，总灰分不得超过7.0%，酸不溶性灰分不得超过2.0%。从检测结果(表2)可以看出，全部甘草样品中水分、总灰分、酸不溶性灰分均符合质量标准，其中来自甘肃省白银市景泰县的3号样品水分最低(6.7%)、2号样品总灰分最低(3.0%)，而来自内蒙古自治区鄂尔多斯市巴音乌素的7号和10号样品酸不溶性灰分最低(0.03%)。

表2 常规检测结果Table 2 Routine test results 单位：%

2.2 重金属的检测甘草的重金属和有害元素依照《中国药典》铅、镉、砷、汞、铜测定法(通则2321电感耦合等离子体质谱法)规定，铅不得超过5 mg/kg，镉不得超过1 mg/kg，砷不得超过2 mg/kg，汞不得超过0.2 mg/kg，铜不得超过20 mg/kg。从表3可以看出，全部甘草样品中铅、镉、砷、汞、铜这5种重金属的残留量均未超过《中国药典》所规定的限度，且内蒙古自治区鄂尔多斯市杭锦旗巴拉贡的样品重金属含量最低。

表3 重金属元素含量 Table 3 Content of heavy metal elements 单位：mg/kg

2.3 甘草苷和甘草酸含量的测定取约0.2 g甘草药材粉末为材料，通过高效液相色谱法测定甘草苷和甘草酸。按《中国药典》干燥品标准计算，含甘草苷(C21H22O9)不得少于0.5%，甘草酸(C42H62O16)不得少于2.0%。从表4可以看出，全部甘草样品中甘草苷和甘草酸均符合国家标准所规定的最低限，其中，甘肃省白银市景泰县2号样品的甘草酸和甘草苷的含量最高，分别为5.5%和3.1%。

2.4 不同产地甘草的质量鉴定

2.4.1逐步判别分析法。运用SPSS 23.0对4个产区的甘草样品的各项检测指标进行非参数检验(K个独立样本的检测)，检测不同产区的各检测指标是否有差异，结果发现(表5)，4个产区之间的水分、酸不溶灰分和汞均存在显著差异(P<0.05)，其他检测指标的差异均不显著(P>0.05)。

对测定结果进行逐步判别分析，根据不同指标，从中筛选出引起显著性差异的样品，剔除多余变量并建立产区判别模型，分析结果显示有5个指标被引入判别模型中，分别是酸不溶灰分、水分、铜、砷、汞。利用5个检测指标建立的判别模型，将产地不同的15份甘草样品分为4组，分别为甘肃省白银市景泰县(G1)、甘肃省兰州市榆中县(G2)、内蒙古自治区鄂尔多斯市巴音乌素(G3)、内蒙古自治区鄂尔多斯市杭锦旗巴拉贡(G4)，其整体产区的回判正确率为100%(表6)。从图1可以看出，4个产区的甘草可以通过这5种指标明显区分，说明这5个指标对甘草产区有较好的判别效果。

表4 甘草苷和甘草酸的含量 Table 4 Contents of glycyrrhizin and glycyrrhizic acid 单位：%

表5 非参数检验统计结果Table 5 Statistical results of nonparametric test

表6 不同产区甘草的分类结果Table 6 Classification results of Glycyrrhiza uralensis in different production areas

图1 典则判别函数Fig.1 Canonical discriminant function

2.4.2熵权TOPSIS法分析。运用SPSSAU在线分析软件，将表2中的水分、总灰分、酸不溶性灰分的数据进行逆向化处理，表4中甘草酸、甘草苷的数据进行正向化处理，处理后的具体结果见表7。熵权TOPSIS法分析中相对贴近度越接近于1，表明该产地的甘草质量越优。从表7可以看出，在甘肃省白银市景泰县的3批甘草中，评分排名分别为9、1、4，甘肃省兰州市榆中县的3批甘草中，评分排名分别为3、2、15，同一产区的药材排名存在较大的差异；在内蒙古自治区鄂尔多斯市巴音乌素的4个批次样品、内蒙古自治区鄂尔多斯市杭锦旗巴拉贡的5个批次样品评分中，排名也存在较大差异。以上结果表明，熵权TOPSIS法分析效果较差，不适用于甘草的质量评价过程。

表7 4个产区甘草TOPSIS评价计算结果Table 7 Calculation results of TOPSIS evaluation of Glycyrrhiza uralensis in four production areas

2.4.3R型聚类分析。聚类分析是指依据样品数据的特征按照一定统计规则确定样品的类别。采用SPSS 23.0软件，将表2中的水分、总灰分、酸不溶性灰分的数据及表4中的甘草酸、甘草苷等数据进行标准化处理，将水分、总灰分、酸不溶性灰分、甘草酸、甘草苷作为分析变量，以Ward接法结合Squared Euclidean Distance距离计算方法对4个产区的15批甘草进行R型聚类分析，结果见图2。从图2可以看出，同一产区批次的甘草聚类效果较为明显，不同产区批次甘草之间具有较好的区分性，系统聚类分析法对于不同产区甘草的质量评价效果明显。其中，内蒙古自治区鄂尔多斯市巴音乌素4个批次的甘草样品聚类分析中属于同一分支，内蒙古自治区鄂尔多斯市杭锦旗巴拉贡5个批次甘草属于同一支，但甘肃省白银市景泰县、甘肃省兰州市榆中县的甘草样品聚类效果较差，可以判定不属于同一支。因此，由聚类分析法可知，甘肃2个产区的样品几乎不属于同一类，而内蒙古2个产区样品聚类效果较好，但无法将甘肃样品区别于内蒙古样品，此法判别效果一般。考虑到该试验所用不同产地甘草的样本量偏少，可能影响聚类分析法的判别效果，若样本量足够充足时，该法可能具有更好的判别效果。

3 结论与讨论

中药材的质量与中药材的效价息息相关。我国是中药材的生产大国，但由于种源混乱和生产管理不规范等原因使得中药材的质量参差不齐，甚至许多不符合质量评价标准的中药材流入市场。因而对于不同产地的中药材质量进行鉴别有利于筛选优良种源的中药，并扩繁优良种源家系的中药材，从而提升中药材的质量与效价。目前对中药材的质量评价体系的建立已经逐步开展。中药材质量的评价依赖于多个项目判别与检测，主要包括药材的性状特征、药效成分、分子标记。

该研究以4个产地(甘肃省白银市景泰县、甘肃省兰州市榆中县、内蒙古自治区鄂尔多斯市巴音乌素、内蒙古自治区鄂尔多斯市杭锦旗巴拉贡)的甘草为材料，根据2020年版《中国药典》所记载的方法测定甘草样品中水分、总灰分、酸不溶性灰分、重金属、甘草酸和甘草苷，结果发现所有样品均符合药典标准，说明从单因素分析4个产地的甘草均符合药材质量的鉴定标准。通过利用多个指标变量进行显著性分析发现，4个不同产地的甘草样品中水分、酸不溶灰分和汞存在显著差异(P<0.05)。再用逐步判别分析说明5个指标(酸不溶灰分、水分、铜、砷、汞)较其他检测指标更适于不同产地甘草的判别，将这5个检测指标引入判别模型，发现所建立的判别模型回判率达到100%，而这也表明5个指标在不同产地间存在较大的差异。利用R型聚类分析发现甘肃2个产区的甘草样品差距较大，不能归为一类，而内蒙古2个产区样品聚类效果较好，但总体而言R型聚类分析无法将甘肃样品区别于内蒙古样品，此法判别效果一般。此外，尽管尝试运用熵权TOPSIS法分析各产地甘草样品的优劣，得到结果发现甘肃2号样品更具有优势，但是由于同一产地重复组样品差距较大，因此不具有统计意义。

综上所述，该研究对不同产地甘草药材的指标进行检测并运用不同统计学方法对数据进行分析，初步判断4种产地的甘草药材符合质量标准。此外，尽管逐步判别分析能使用5个指标(酸不溶灰分、水分、铜、砷、汞)判别不同产地的甘草，但事实上对不同指标的数据进行统计分析仍较为困难，无法准确判断不同产地甘草的优劣。分析原因可能是该试验所检测指标易受气候环境、种植模式、采收加工等因素的影响，因此为了准确判别不同产地甘草的优劣势，计划利用大量样品和检测指标，并进一步运用更多不同的统计方法筛选剔除不合理数据进一步分析验证。

图2 4个产区甘草药材的R型聚类分析Fig.2 R-type cluster analysis of Glycyrrhiza uralensis in 4 production areas