共生菌对小鼠肺脏组织核转录因子κB与抑制性κB激酶α/β及磷脂酰肌醇3-激酶表达的调控作用

查艳芳，杨雯雯，户守鑫，崔克乐，胡世莲，程民,

1.中国科学技术大学附属第一医院西区(安徽省肿瘤医院)肿瘤分子实验室，合肥 230031；2.中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)

呼吸道共生菌在维持肺脏免疫稳态以及肺脏疾病发生发展过程中均具有重要作用。肠道共生菌与肺脏关系密切，在体内形成“肠-肺”轴，远端调控肺脏免疫稳态及免疫应答。核转录因子κB(NF-κB)、抑制性κB激酶α/β(IKK-α/β)及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)等信号通路分子参与多种细胞功能的调节，与炎症、肿瘤、哮喘等多种肺脏疾病的发生发展密切相关。共生菌对肺脏组织中NF-κB、IKK-α/β及PI3K等分子表达水平的调控值得深入研究。本研究通过检测共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺脏组织中NF-κB、IKK-α/β、PI3K的表达量及其磷酸化水平，探讨共生菌对肺脏NF-κB、IKK-α/β、PI3K表达的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6小鼠(SPF级)购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，5～6周龄，雌性，共12只，按体重随机分为两组(实验组和对照组)，6只/组；饲养条件为22 ℃、55%相对湿度、昼/夜(12 h/12 h)节奏，饲养和实验操作均遵循中国科学技术大学实验动物管理规范条例执行。

1.1.2 抗菌药物 万古霉素(货号：S17059)购自上海源叶生物科技有限公司。氨苄青霉素(货号：A610028)、新霉素(货号：A610366)和甲硝唑(货号：A600633)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 组织蛋白提取及定量试剂 Western及IP细胞裂解液(货号：P0013)及BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：P0010)购自碧云天生物技术有限公司；磷酸酶抑制剂片(货号：4906845001)及蛋白酶抑制剂混合片(货号：04693124001)购自Roche公司。

1.1.4 抗体 NF-κB p65 (L8F6) mouse mAb(货号：6956)、IKK-α antibody(货号：2682)、IKK-β (2C8) rabbit mAb(货号：2370)、PI3 Kinase p85 Antibody(货号：4292)、phospho-NF-κB (Ser536) (93H1) rabbit mAb(货号：4025)、phospho-IKK-α/β (Ser176/180) (16A6) rabbit mAb(货号：2697)、phospho-PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) antibody(货号：4228)、β-actin antibody(货号：4967)、anti-rabbit IgG HRP-linked antibody(货号：7074)、anti-mouse IgG HRP-linked antibody(货号：7076)均购自Cell Signaling公司。

1.1.5 SDS-PAGE电泳、转膜及显色试剂 SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(货号：P0012A)、彩色预染蛋白质分子量标准(货号：P0068)及极超敏ECL化学发光试剂盒(货号：P0018FM)均购自碧云天生物技术有限公司；PVDF膜(货号：IPVH00010)购自Miilipore公司。

1.2 方法

1.2.1 共生菌缺失小鼠模型的建立 使用含万古霉素(0.5 g/L)、氨苄青霉素(1.0 g/L)、甲硝唑(1.0 g/L)及新霉素(1.0 g/L)4种抗菌药物的饮用水连续饲喂实验组C57BL/6小鼠(5～6周龄，雌性，SPF级，共6只)5周，构建共生菌缺失小鼠模型[1]。实验过程中对照组小鼠使用不含抗菌药物的饮用水进行饲喂。

1.2.2 肺脏标本获取 将共生菌缺失小鼠及正常对照小鼠(各6只)摘眼球取血后，脱臼处死，解剖小鼠。取100 mg肺脏组织，放入1.8 mL冻存管中，保存于-80 ℃冰箱中，备用。

1.2.3 肺脏组织蛋白提取及定量 取-80 ℃保存的小鼠肺脏组织，每管加入500 μL Western及IP细胞裂解液(含蛋白酶及磷酸酶抑制剂)，60 Hz，研磨2 min，冰上放置10 min。12 000 g，4 ℃，离心10 min。将上清转移至1.5 mL无菌EP管中，12 000 g，4 ℃，离心10 min。吸取上清液，使用BCA试剂盒进行蛋白定量，并将定量后的肺脏蛋白分装至0.5 mL无菌EP管中，-80 ℃保存，备用。

1.2.4 Western blot检测 将待测的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳(8%浓缩胶，10%分离胶)，上样量50 μg总蛋白/孔，浓缩胶80 V，电泳30 min；分离胶120 V，电泳1 h。利用半干法将凝胶上的蛋白转至PVDF膜；之后进行封闭、一抗标记、二抗标记等，用ECL发光试剂盒进行显色，化学发光仪成像，用Image J软件进行条带分析。

2 结果

2.1 共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺脏组织中NF-κB的表达情况及其磷酸化水平 利用Western blot方法检测NF-κB蛋白的表达情况及其磷酸化水平，结果显示，共生菌缺失小鼠肺脏中NF-κB蛋白的相对表达量为1.609±0.084，较正常小鼠肺脏(1.000±0.000)升高(t=7.287，P<0.01)，磷酸化NF-κB蛋白(pho-NF-κB)的相对表达水平为2.039±0.133，亦高于正常小鼠肺脏(1.000±0.000)(t=7.812；P<0.01)。见图1。

图1 Western blot方法检测共生菌缺失小鼠肺脏组织中NF-κB蛋白的电泳条带(n=6)

2.2 共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺脏组织中IKK-α、IKK-β的表达情况及其磷酸化水平 利用Western blot方法检测IKK-α、IKK-β蛋白的表达情况及其磷酸化水平，结果显示，共生菌缺失小鼠肺脏中IKK-α蛋白的相对表达量为1.206±0.095，与正常小鼠肺脏(1.000±0.000)相比无明显变化(t=2.170；P=0.055)，IKK-β蛋白的相对表达量为3.389±0.184，较正常小鼠肺脏(1.000±0.000)升高(t=13.012，P<0.01)，磷酸化IKK-α/β蛋白(pho-IKK-α/β)的相对表达水平为1.433±0.053，亦高于正常小鼠肺脏(1.000±0.000)(t=8.203，P<0.01)。见图2。

图2 Western blot方法检测共生菌缺失小鼠肺脏组织中IKK-α、IKK-β蛋白的电泳条带(n=6)

2.3 共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺脏组织中PI3K的表达情况及其磷酸化水平 利用Western blot方法检测PI3K蛋白的表达情况及其磷酸化水平，结果显示，共生菌缺失小鼠肺脏中PI3K蛋白的相对表达量为1.414±0.024，较正常小鼠肺脏(1.000±0.000)升高(t=17.206；P<0.01)，磷酸化PI3K蛋白(pho-PI3K p85/p55)的相对表达水平为3.171±0.237亦高于正常小鼠肺脏(1.000±0.000)(t=9.160；P<0.01)。见图3。

图3 Western blot方法检测共生菌缺失小鼠肺脏组织中PI3K蛋白的电泳条带(n=6)

3 讨论

共生菌在维持黏膜免疫系统稳态中发挥着重要的作用，共生菌与免疫系统之间存在错综复杂的关系与精妙的平衡[2]。呼吸道共生菌在维持肺脏免疫稳态以及肺脏疾病发生发展过程中均具有重要作用[3-5]。肠道共生菌亦可远端调控肺脏免疫稳态及免疫应答[6]。本课题组前期的研究发现，共生菌缺失小鼠较正常小鼠更易发生肺部肿瘤，共生菌缺失导致肺脏γδT细胞及肺泡巨噬细胞功能变化，进而导致肿瘤进展[1,7]，但共生菌缺失对小鼠肺脏组织中信号通路分子，特别是NF-κB、IKK-α/β及PI3K等分子表达及其磷酸化水平的影响尚不明确。

在哺乳动物中，NF-κB由5个普遍表达的成员(p50、p52、p65/RelA、RelB和c-Rel)组成，形成同源或异二聚体[8]。在非活性状态下，NF-κB存在于胞浆内，并与IκB家族(IKKs)的抑制蛋白相结合。细菌脂多糖、病毒、氧化剂、细胞因子等与细胞膜上的受体蛋白结合，活化IKK并释放NF-κB二聚体，自由的NF-κB进入细胞核，调控靶基因的转录表达[9]。IKK作为NF-κB信号转导途径的重要成员，包括催化亚基IKKα、IKKβ及调节亚基IKKγ 3个亚基。IKK/NF-κB信号通路在哮喘、神经退行性变、炎症和癌症等的发病机制中起着至关重要的作用。IKK-α信号可通过活化Erk、p38和mTor等蛋白，或上调EGFR和NF-κB活性及激活c-Myc、Smad2/3和Snail信号进而加速肺脏肿瘤的进展[10]。IKK-β/NF-κB信号通过调控癌细胞的生存、凋亡和迁移等改变多种肿瘤的致癌能力[11]。

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)是一类调节细胞增殖、代谢、蛋白质合成和存活的胞内磷脂酰肌醇激酶[12]，参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。PI3K信号通路过度活化与恶性肿瘤的发生发展密切相关。目前，多项临床试验均证实了PI3K抑制剂在实体瘤中的疗效，包括子宫内膜癌、乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等[13]。在肺癌中，PI3K信号上调表达可促进肺癌细胞增殖、存活和组织侵袭等，PI3K信号上调与口腔部位的共生菌在下呼吸道富集密切相关[4]。

本研究通过检测共生菌缺失小鼠及正常小鼠肺脏NF-κB、IKK-α/β及PI3K的表达情况及其磷酸化水平，发现共生菌缺失小鼠肺脏中NF-κB蛋白的表达量及其磷酸化水平均较正常小鼠肺脏升高(P<0.01)；IKK-α蛋白的表达水平与正常小鼠肺脏相比无明显变化(P>0.05)，但IKK-β蛋白的表达水平及IKK-α/β蛋白的磷酸化程度均高于正常小鼠肺脏组织(P<0.01)；PI3K蛋白的表达水平及PI3K蛋白(p85/p55)的磷酸化程度亦高于正常小鼠肺脏组织(P<0.01)。上述结果表明共生菌可以调控肺脏组织中NF-κB、IKK-α/β及PI3K等分子表达量及其磷酸化水平，本研究结果为进一步探索共生菌在肺脏免疫稳态维持、肺脏疾病发生发展过程中的作用及作用机制提供了新的依据和参考。