血红素氧合酶-1对大鼠肝脏缺血再灌注NF-κB p65和细胞凋亡的影响

吕飒美，吴友伟，周健，史丽萍

(陕西省人民医院消化内2科，西安 710068)

·基础研究·

血红素氧合酶-1对大鼠肝脏缺血再灌注NF-κB p65和细胞凋亡的影响

吕飒美，吴友伟，周健，史丽萍

(陕西省人民医院消化内2科，西安 710068)

目的 探讨血红素氧合酶-1(HO-1)对大鼠肝脏缺血再灌注NF-κB P65、细胞凋亡的影响。方法 SD大鼠采用随机数字表法分成5组：正常组(N)，假手术组(S)，手术组(I/R建立肝脏缺血再灌注损伤模型)，手术给药Ⅰ组(I/R+hemin)，手术给药Ⅱ组(I/R+ZnPP)，手术后6 h、 12 h下腔静脉取血分离血清检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)。Western blot方法测定肝脏NF-κB p65的表达，免疫组化方法测定肝脏Fas蛋白的表达。结果 ①hemin组 ALT、AST较I/R组及ZnPP组明显降低(P<0.01)；②肝组织NF-κB p65的表达：hemin组NF-κB p65表达比同期I/R组减少(P<0.01)；ZnPP组NF-κB p65表达比同期I/R组增多(P<0.01)； ③肝组织Fas：hemin组Fas表达减少(P<0.05)，ZnPP组Fas表达明显增多(P<0.01)。结论 HO-1对肝脏缺血/再灌注损伤的保护作用与NF-κBP65密切相关，可能通过抑制NF-κB p65的活性来减少细胞凋亡。

肝疾病；再灌注损伤 ;p65亚基NF-κB;氧合酶类;大鼠,sprague-dawley

血红素氧合酶-1(HO-1)是生物体内催化血红素分解过程中一种关键的限速酶，具有重要的生物作用。近年来发现，其在细胞应激、组织损伤及细胞凋亡的防治中发挥着一定的作用[1]。核因子NF-KB能与多种细胞基因启动子或增强子序列特定位点发生特异性结合而促进转录和表达，与炎症反应、免疫应答以及细胞的增生、转化和凋亡等重要的病理生理过程密切相关。国外研究表明[2-3]：NF-κB在某些环境下可以促进细胞的凋亡，本实验通过建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型，探讨血红素氧合酶-1对大鼠肝脏缺血再灌注NF-κBP65、细胞凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1 材料 实验动物：选用西安交通大学医学部动物实验中心提供的SD雄性大鼠54只，体重200～275 g，合格证号：SCXK(陕)2007-002。主要试剂：Hemin Znpp均购于美国Sigma公司；兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗体及DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 缺血再灌注模型建立 大鼠禁食12 h后，氯胺酮80 mg/kg腹腔内注射麻醉。

建立原位肝I/R模型：取上腹正中切口，入腹后分离肝十二指肠韧带，充分显露第一肝门部， 用无损伤血管夹夹闭肝中叶和左外侧叶的肝动脉、门静脉， 以造成70%的肝脏缺血模型，但不阻断肝右叶、尾状叶血流，以防胃肠道淤血及再灌注后肠道内的细菌和内毒素回流入肝脏对实验结果造成的不良影响。当缺血30 min后，松开血管夹，恢复缺血肝叶的入肝血流。N组仅剖腹取血及肝组织，S组入腹后只游离肝门血管，不阻断肝门血供，于术后第6、12 小时取血及肝组织；I/R组及I/R+hemin组、I/R+ZnPP组均进行I/R手术，并分别再灌注后第6、12小时处死动物，取血、切取肝左叶组织，分别用于各项指标测定、组织学检查。

1．3 实验分组 采用随机数字表法将实验动物分为5组。⑴正常组(N)6只；⑵假手术组(S)12只；⑶手术组(I/R)：12只，游离肝门血管，分清供应肝左叶和中叶的肝动脉和门静脉，肝脏缺血30 min，再灌注6 h和12 h；⑷手术给药Ⅰ组(I/R+hemin)：12只，术前24 h、12 h大鼠腹腔注射hemin(氯铁血红素)，每次30 μmol/kg体重，余同手术组；⑸手术给药Ⅱ组(I/R+ZnPP)：12只术前24 h、12 h大鼠腹腔注射ZAPP，每次10 μmol/kg体重；其余各组予等量生理盐水腹腔注射。其中S组、I/R组、I/R+hemin组和I/R+ZnPP组再各分为缺血再灌注后6 h及12 h两个亚组。

1．4 观察项目 ①血清肝脏酶学指标检测：手术后6 h、 12 h下腔静脉取血分离血清用全自动生化分析仪检测血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)。②Western Blot方法测定肝脏NF-κBp65的表达。③免疫组化染色检测肝组织Fas蛋白的表达，以细胞浆内呈现黄褐色颗粒为阳性细胞，用Motic Med 6.0医学病理图像分析系统对图象进行采集和分析。灰度值数值越小，表明阳性表达越多。

1.5 统计学处理 采用SPSS15.0软件进行统计学分析，各组间比较进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 血清ALT、AST检测结果 肝脏缺血再灌注后I/R组与S组相比，术后6 h和12 h时血清ALT、AST明显增高(P<0.01)，术前给予hemin，则在再灌注6 h、12 h时，血清ALT、AST均比同期I/R组血清ALT、AST水平降低(P<0.01)，术前给予ZnPP，则在再灌注6 h、12 h时，血清ALT、AST均比同期I/R组血清ALT、AST水平增高(P<0.01)，见表1。

2.2 各组大鼠肝组织Fas蛋白免疫组化染色结果 肝脏缺血再灌注后6 h、12 h时，I/R+hemin组与同期I/R组比较，发现I/R+hemin组Fas表达减少(P<0.01)，I/R+ZnPP组与同期I/R组比较，发现I/R+ ZnPP组Fas表达增多(P<0.05)，见表1，图1。

表1 各组6 h、12 h测定结果对比

注：与正常组比较，aP<0.01；与假手术组比较，bP<0.01；与I/R比较，cP<0.01,dP<0.05

2．3 各组大鼠肝组织NF-κB P65 Western plot测定结果 I/R组和S组、N组比较，在再灌注6 h、12 h时，肝组织NF-κB p65表达明显增高(P<0.01)；与I/R+hemin组比较，发现再灌注6 h、12 h时，I/R+hemin组的NF-κB p65的表达明显低于同期I/R组(P<0.01)，I/R+ZnPP组的NF-κB p65的表达明显高于同期I/R组(P<0.01)，见表1，图2。

3 讨论

HO-1作为亚铁血红素代谢的关键酶，不仅能催化血红素生成一氧化碳、自由铁和胆绿素，而且具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、调节微循环的作用，抗凋亡的作用也成为研究热点[4]。血清ALT、AST是反应肝脏损伤的重要酶学指标。本实验中，I/R组血清ALT、AST活性显著升高，提示缺血再灌注后肝脏发生明显组织病理损伤，hemin组，在再灌注6 h、12 h时，血清ALT、AST均比同期I/R组水平降低(P<0.01)，ZnPP组，则在再灌注6 h、12 h时，血清ALT、AST均比同期I/R组血清ALT、AST水平增高(P<0.01)，说明HO-l对缺血再灌注后肝组织损伤具有保护作用。这种保护作用究竟通过什么机制而来，很多学者认为NF-κB起了关键作用。NF-κB可能是启动Fas及Fas配体等促凋亡基因表达的重要转录因子，肝脏缺血再灌注过程中NF-κB活化可以调节凋亡最重要相关基因的表达，可能引起凋亡基因表达上升、抑凋亡基因表达下降，最终导致细胞凋亡[5]。

Ben-Ari等[6]发现诱导HO-1，对肝脏I/R有保护作用，NF-κB的抑制蛋白IκBa增多，NF-κB表达减少，肝细胞凋亡减少。本研究通过建立肝脏I/R模型观察NF-κB变化，也取得相类似的结果，发现在再灌注6 h、12 h时，I/R组肝组织NF-κB p65的表达较N组、S组明显增高，说明肝脏缺血再灌注时NF-κB的活性增高，通过NF-κB的活化上调致炎性细胞因子的表达，导致肝脏的损害，同时发现HO-1高表达时NF-κB p65表达减少，Fas蛋白表达降低，而抑制HO-1表达时NF-κB p65表达增高，Fas蛋白表达增高，推测HO-1可以减少细胞凋亡，可能通过抑制NF-κB p65的活性，减少细胞通过Fas/FasL通路发生凋亡，从而达到减轻肝脏缺血再灌注损伤的作用。

HO-1的肝脏保护作用可能与抑制NF-κB p65的活性有关，但HO-1通过何种途径抑制NF-κB p65的活性，是否是因为NF-κB的抑制蛋白IκBa的增加，还是通过其他的机制，并不十分清楚，尚有待于进一步研究。

(本文图1,2见插图5-2)

[1] Wu BJ,Chen K,Barter PJ,et al.Niacin inhibits vascular inflammation via the induction of heme Oxygenase-1[J].Circulation,2012,125(1):150-158.

[2] Sass G,Barikbin R,Tiegs G.The multiple functions of heme oxygenase-1 in the liver[J].Z Gastroenterol,2012，50(1):34-40.

[3] Karin M.NF-kappaB and cancer: mechanisms and targets[J].Mol Carcinog，2006.45(6): 355-361.

[4] Choi BM,Lim DW，Lee JA，et al.Luteolin suppresses cisplatin induced apoptosis in auditory cells：possible mediation through induction of heme oxygenase-1 expression[J].J Med Food，2008,11(2)：230-236.

[5] Gutierrez SH,Kuri MR,del CER.Cardiac role of the transcription factor NF-kappaB[J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets,2008,8(2): 153-160.

[6] Ben-Ari Z,Issan Y,Katz Y，et al.Induction of heme oxygenase-1 protects mouse liver from apoptotic ischemia/reperfusion injury[J].Apoptosis,2013,18(5):547-555.

Effects of heme oxygenase-1 on NF-κB p65 and apoptosis in rats during the liver ischemia /reperfusiondamage

LvSaimei，WuYouwei，ZhouJian，ShiLiping

(DepartmentofDigestionⅡ，ShanxiProvincialPeople′sHospital，Xi′an710068，China)

Objective To explore the effects of Heme Oxygenase-1 on NF-κB P65 and apoptosis in rats during the liver ischemia/eperfusion damage.Methods SD rats were randomly divided into five groups：normal control group，sham group，I/R group， I/R+hemin group，and I/R+ZnPP group.Blood samples were collected from the postcava at 6h and12h after the operation，and the serum was isolated to measure alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST).The expressions of NF-κBp65 and Fas protein in livers of rats were examined by western blot and immunohistochemistry.Results ①The levels of ALT and AST were significantly lower in hemin group than those in I/R group and ZnPP group(P<0.01).②The expression of NF-κB p65 was lower in hemin group than those in I/R group(P<0.01);the expression of NF-κB p65 was higher in ZnPP group than those in I/R group (P<0.05).③The expression of Fas protein was markedly increased in ZnPP group than those in hemin group(P<0.01).Conclusion Protective effects of HO-1 against hepatic ischemia/reperfusion damage were closely related to the reduced NF-κB P65 expression,which maybe decreased the apoptosis via inhibit activity of NF-κBp65.

Liver diseases;Reperfusion injury;NF-kappa B p65 subunit;Oxygenases;Rats,sprague-dawley

吕飒美，副主任医师,Email：daodao2002@126.com

R575

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2015.05.018

2015-05-07)