基于iTRAQ技术的蛋白质组学应用于慢性肾脏病研究的进展

宋业旭，贠捷，马晓鹏，裴春鹏，金丽霞，赵大鹏，马艳春，宋立群

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院)

·综述·

基于iTRAQ技术的蛋白质组学应用于慢性肾脏病研究的进展

宋业旭1，贠捷2，马晓鹏2，裴春鹏2，金丽霞2，赵大鹏2，马艳春1，宋立群2

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第一医院)

自1994年蛋白质组学的概念被提出以来，蛋白质组学已经应用在生命科学和医学的各个领域，并成为“后基因时代”的研究热点。蛋白质作为生物功能的具体执行者，对其的表达水平、翻译后修饰、转运定位、蛋白质之间相互作用及蛋白与其他生物分子相互作用的研究，可以获得蛋白质水平上的对疾病发生机制、临床诊断、药物治疗机制等方面的认识[1-2]。

1 蛋白质组学技术

对蛋白质进行研究的主要内容是蛋白质的分离、鉴定和定量研究。对蛋白质的定性研究常用的是蛋白质质谱鉴定(如MALDI-TOF/TOF、LC-ESI-MS/MS)和Shotgun混合蛋白质鉴定。对蛋白质定量研究包括凝胶路线(如2D双向凝胶电泳和DIGE荧光差异双向凝胶电泳)、质谱路线(如Label free非标记质谱定量、iTRAQ质谱定量、SILAC质谱定量、SRM /MRM目标蛋白绝对定量)。对蛋白质修饰分析常用技术如修饰肽段富集LC-MS/MS。

2 相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)技术原理

2004年美国应用生物系统公司推出一项新的体外同位素标记技术，即iTRAQ。iTRAQ试剂分为4标和8标两种，其原理是采用与氨基反应等量的异位标签，通过与多台氨基基团共价反应而达到标记的作用。以8标试剂为例，其标签分子量为145，由报道基团(相对分子量分别为121、119、118、117、116、115、114、113)、质量平衡臂(质量分别为24、26、27、28、29、30、31、32)和一个相同的多肽反应基团组成。因此在进行质谱鉴定时，标记后第一级质谱检测时，其分子量完全相同。进行第二级质谱分析时，不同同位素标签可产生不同信号离子。通过蛋白质序列数据库搜索标记后多肽肽键断裂所产生的离子串，可确定蛋白质前体组成，并通过测定信号离子丰度检测样本中蛋白丰度。

3 iTRAQ技术的优势

尽管传统的双向凝胶电泳(2-DE)方法应用比较广泛，但双向电泳本身的局限性，比如疏水性蛋白和膜蛋白难以溶解，低丰度蛋白受到高丰度蛋白的影响，极酸或及极碱性蛋白受到一维固相pH梯度等电聚焦和电渗流等问题的影响，小分子量蛋白可能与有力的十二烷基磺酸钠离子对流混合，故难以检测出疏水性蛋白、膜蛋白、低丰度蛋白、极性蛋白、小分子量蛋白等。

iTRAQ试剂最多可同时对8组样品的蛋白进行定量的蛋白质组学研究，提高了组间分析的准确性。iTRAQ的标记机制对蛋白质翻译后修饰位点没有影响，可达到对蛋白质翻译后修饰如磷酸化、泛素化等方面研究的要求。最重要的是iTRAQ所需样本来源广泛，细胞、组织、血浆、血清、尿液，甚至唾液、脑脊液、泪液、鼻分泌物等均可作为检测样本，便于筛选临床诊断指标的研究。

有研究[3-4]分别用2-DE分离差异蛋白点和iTRAQ标记样本后使用MALD ITOF/TOF串联飞行质谱对背根神经节细胞进行蛋白的鉴定，结果显示2-DE方法分离出4种差异蛋白，而iTRAQ技术发现22中蛋白的变化，其中2-DE鉴定出的4种上调蛋白为结构蛋白和信号转导蛋白，且蛋白量的变化都在2倍以上，而iTRAQ技术鉴定的22中上调蛋白为结构蛋白、信号蛋白、代谢蛋白、降解蛋白、细胞基质蛋白等，蛋白变化在1.3～1.6之间。说明iTRAQ技术在鉴定和比较总蛋白的数量和种类上有明显的优势。Wu等[4]通过比较DIGE、ICAT及iTRAQ三种蛋白定量方法研究已知蛋白混合物，结果发现三种方法都能对蛋白混合物准确定量，但iTRAQ是最敏感的定量方法。

4 iTRAQ技术在肾脏疾病方面的应用

目前iTRAQ在肾脏疾病方面的应用主要集中在寻找临床诊断标记物方面。Overgaard等[5]将123名1型糖尿病患者按尿蛋白量分成三组，分别为无蛋白尿组、微量蛋白尿组(尿微量蛋白在30～300 mg/24 h)、大量蛋白尿即糖尿病肾病组(尿微量蛋白大于300 mg/24 h)。将三组患者血清样本混合成三份样本，并用iTRAQ试剂标记，纳升液相色谱仪进行蛋白质鉴定，通过Proteome Discoverer软件处理数据，IPA软件分析蛋白质功能通路。实验鉴定出112个差异蛋白，通过研究差异蛋白之间的关系，认为糖尿病肾病的进展和心血管并发症的发生与脂蛋白A2、B、C3、D和E关系密切，并通过多重免疫分析方法选取糖尿病肾病快速进展和缓慢进展的患者对iTRAQ结果进行验证，认为所发现的差异蛋白中可能作为对糖尿病肾病的早期诊断和预后的生物标记物。王玉等[6]通过iTRAQ标记的二维液相色谱与串联质谱连用技术检测临床患者尿液蛋白质组学，并比较以肾病综合征为主要表现的30例患者的尿液。按其病理改变不同分为两组，15例为膜性肾病组，15例为局灶节段性肾小球硬化组，随机将组内每5人尿液合为一个样本并清除白蛋白/IgG抗体，在总共6组样品中共鉴定出809个蛋白，其中丰度排名前十位的蛋白涉及代谢、细胞活动、发育调控、免疫刺激反应等多个方面，差异蛋白共鉴定出16个，涉及纤溶、免疫反应、代谢、细胞增生等过程。有研究[7-9]结合iTRAQ标记并采用高效液相-四级杆飞行时间串联质谱技术分析三例病理诊断为V型狼疮性肾炎患者肾组织，并与正常组(1例为肾肿瘤患者远离病灶的正常肾组织和2例非肾性血尿患者肾组织)相对比，共鉴定出512个蛋白，筛选出18个显著差异蛋白，认为其差异蛋白质的主要功能是激酶和氧化还原酶。

5 展望

使用iTRAQ标记的肾脏蛋白质组学方面的研究还处于起步阶段。iTRAQ结合多维液相色谱和串联质谱技术也有一定的局限性，比如iTRAQ试剂几乎可以与样本中所有蛋白质相结合，易受样本中杂质蛋白污染，所得的数据需要复杂的生物信息学工具才能进行分析，而且每次实验都必须鉴别全部的蛋白质组。当前iTRAQ在肾脏疾病方面的应用主要集中在寻找临床诊断标记物方面，对药物作用靶点、疾病机制等方面的应用尚不完善，因此，随着蛋白质组学的深入研究，相信应用iTRAQ技术必将为了解蛋白质在肾脏疾病中的作用做出积极的贡献。

[1] Ross PL,Huang YN,Marchese JN,et al.Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents[J].Mol & cell prot,2004,3(12):1154-1169.

[2] Harry JL,Wilkins MR,Herbert BR,et al.Proteomics:capacity versus utility[J].Electrophoresis,2000,21(6):1071-1081.

[3] 潘三强,宿宝贵,吕来清.二维电泳和 iTRAQ 的实验比较[J].神经解剖学杂志,2008,24(5):538-542.

[4] Wu WW,Wang G,Baek SJ,et al.Comparative study of three proteomic quantitative methods,DIGE,cICAT,and iTRAQ,using 2D gel-or LC-MALDI TOF/TOF[J].JPR,2006,5(3):651-658.

[5] Overgaard AJ,Thingholm TE,Larsen MR,et al.Quantitative iTRAQ-based proteomic identification of candidate biomarkers for diabetic nephropathy in plasma of type 1 diabetic patients[J].Clin Prot,2010,6(4):105-114.

[6] 王玉,孙伟,左科,等.肾小球疾病患者尿液比较蛋白质组学研究方法的建立[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2014,23(2):140-145.

[7] Sui W,Tang D,Zou G,et al.Differential proteomic analysis of renal tissue in lupus nephritis using iTRAQ reagent technology[J].Rheumatol Int,2012,32(11):3537-3543.

[8] Choe LH,Aggarwal K,Franck Z,et al.A comparison of the consistency of proteome quantitation using two‐dimensional electrophoresis and shotgun isobaric tagging in Escherichia coli cells[J].Electrophoresis,2005,26(12):2437-2449.

[9] DeSouza L,Diehl G,Rodrigues M J,et al.Search for cancer markers from endometrial tissues using differentially labeled tags iTRAQ and cICAT with multidimensional liquid chromatography and tandem mass spectrometry[J].JPR,2005,4(2):377-386.

国家自然科学基金资助(81273911)

宋业旭，博士，研究实习员，Email:leaf615@sina.com

宋立群，教授，博士生导师，Email:qunli@sina.com

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10.3969/J.issn.1672-6790.2015.05.033

2015-03-10)