人乳头瘤病毒-16 E5蛋白的功能及E5蛋白与E6、E7蛋白的相互作用

项先旺，江彤，陈传俊，3

(1.安徽医科大学第三附属医院口腔颌面外科，合肥 230061；2.安徽农业大学植物保护学院；3.皖南医学院口腔医学院)

·综述·

人乳头瘤病毒-16 E5蛋白的功能及E5蛋白与E6、E7蛋白的相互作用

项先旺1，江彤2，陈传俊1，3

(1.安徽医科大学第三附属医院口腔颌面外科，合肥 230061；2.安徽农业大学植物保护学院；3.皖南医学院口腔医学院)

人乳头瘤病毒(HPV)是一种双链环状小DNA病毒，与一些恶性肿瘤密切相关，95%的宫颈癌的病例中都能检测到人乳头状病毒，口腔舌癌中HPV感染占60%。目前已发现的HPV亚型有180余种，根据HPV感染部位的不同分为皮肤型和黏膜型，黏膜型又可分为高危型人乳头瘤病毒和低危型人乳头瘤病毒。高危型(常见HPV-16，18,31,32,58)与黏膜恶性病变(如宫颈癌和口腔鳞癌)关系密切，低危型(常见HPV-6,11)则常与良性病变(如尖锐湿疣)有关[1]。高危型人乳头瘤病毒因高致癌性现研究较多，其主要含有3个致癌基因，分别为E5、E6和E7。在宫颈癌中可检测到E6和E7蛋白的持续表达，并且已证实了E6和E7能引起各种细胞的永生化[2]，其机制是E6和E7分别抑制了p53和 pRb的活性，从而引起正常组织细胞周期发生改变和细胞的恶性转化[3]。相对于E6和E7，E5蛋白因强疏水性和非免疫原性使其从蛋白水平上的检测难度加大，而且E5在细胞中表达水平较低，在肿瘤形成的早期阶段发挥作用，其本身也不能使人细胞永生化，在后期病毒基因整合到宿主时常常发生缺失[4]，不同的是也有学者在一些恶性的宫颈癌细胞中检测到E5基因和E5蛋白的表达[5]。这些都造成了对E5的结构和功能的研究受到限制。近年来关于HPV-16 E5蛋白研究表明其可以通过多种机制(包括与E6、E7的互助)参与细胞的恶性转化。本文总结最新的研究结果，对HPV-16 E5在细胞恶性转化中的多种信号传导途径及E5与E6、E7的相互作用一些问题作一综述。

1 HPV-16 E5的功能

1.1 HPV-16 E5蛋白对EGFR信号通路的调节 大量研究表明HPV16 E5蛋白主要的转化作用与表皮生长因子受体(EGFR)信号通路有关[6-8]。在很多肿瘤中都可以发现EGFR的过表达，活化的EGFR可通过Ras-Raf-MAP激酶或PI3K-Akt的途径调节基因的转录、细胞的增值和凋亡、血管的生产及肿瘤的侵袭和转移[9]。对高危型 HPV-16 E5转基因小鼠模型研究发现E5诱导的表皮增生和皮肤肿瘤的形成需要EGFR的参与；Genther等[10]将HPV16 E5分别转染含显性失活突变EGFR的基因小鼠和含野生型EGFR的小鼠体内，前者上皮细胞增生减弱，说明E5蛋白和EGFR协同刺激细胞的增值的。HPV16 E5转化细胞表面EGFR的增高主要是由于E5蛋白与V-ATPase 16-kDa的亚基结合抑制了EGFR的降解，同时E5也能通过阻断EGFR的泛素化而抑制其降解[11]。细胞表面EGFR表达的增加也会增强EGF介导的生长信号。实际上，人们发现EGF处理的E5转化细胞能通过蛋白激酶C(PKC)依赖或非依赖途径诱导MAPK-ERK1/2的超活化[12]，ERK1/2有促进细胞的生长和新陈代谢的作用，这种对ERK1/2超激活会导致恶性肿瘤细胞的生长。E5可以通过EGFR依赖的方式使细胞进入细胞周期S期，在E5转化的NIH3T3的细胞中可检测到EGFR的过表达和DNA的合成的增加，这是由于抑制了p27/Kip1[13]，其下调在恶性肿瘤转化中扮演者非常重要的作用。然而，E5在细胞周期中其他旁路途径现没有明确深入的研究，p27/Kip1的下调是否发生在EGFR诱导的生长信号的下游还是单独的激活途径现在并不清楚。

1.2 HPV-16 E5蛋白与肿瘤的形成 HPV16 E5首先以癌蛋白的身份研究时是基于对E5转化的3T3-A313细胞的观察。研究发现这些转化的细胞能在低血清培养基生长，且生长较快，呈锚定非依赖性生长。随后又发现，E5转化的免疫缺陷型小鼠比野生型更易致瘤，且诱导其上皮肿瘤的发生率比野生型要高。多倍体核型和甲基化在大多数肿瘤中都会发生，研究表明HPV-16 E5的表达能使多倍体核型增多，导致DNA的再复制[14]。E5、L1和L2基因的 CpG高水平的甲基化与宫颈高度病变有关，而E1和E6基因低水平甲基化则与低度病变有关[15]。之前就有研究发现HPV-16的DNA甲基化的水平在肿瘤的进程中是逐渐降低的，最近的研究也证实这一点，发现HPV16甲基化的增强可造成高度病变的可能[16]。甲基化状态的改变在很多种肿瘤中都有报道，而在HPV诱导的肿瘤中，甲基化状态改变可能是其独立的生物学特性。血管生产对肿瘤生长和转移具有重要的作用，而在血管生成中起重要的调节作用的是血管内皮生长因子(VEGF)，其可以促进细胞的增值、迁移及增强血管的通透性，而研究发现HPV16 E5可通过EGFR途径和COX-2-PGE2途径诱导VEGF的表达。细胞凋亡的抑制是几乎所有肿瘤标志性特点，据报道，HPV16 E5蛋白可通过下调Fas的表达和改变TRAIL激发的死亡诱导信号复合物(DISC)抑制HaCaT细胞Fas配体和TRAIL配体介导的细胞凋亡[17]。而且，HPV16 E5蛋白也可通过刺激泛素蛋白酶体介导的促凋亡蛋白Bax的降解，抑制过氧化氢诱导的细胞凋亡，这种降解受COX-2-PGE2信号途径调控[18]。

1.3 HPV-16 E5蛋白协助感染细胞逃避免疫反应 HPV16 感染早期，高表达的E5蛋白可与主要组织相容性复合物Ⅰ类抗原( MHC-Ⅰ)分子直接结合，使细胞膜表面 MHC-Ⅰ分子表达减少，同时E5 蛋白可抑制人白细胞抗原HLA‐A2的表达，干扰 CD8+T 细胞识别病毒抗原。E5 蛋白下调细胞表面和高尔基复合体中聚集的 MHC/HLA Ⅰ类分子，有助于形成 HPV 持续性感染，并逃避宿主的免疫监视[19-20]。Miura[21]发现E5在内质网中与人钙联蛋白6结合，使抗原提呈细胞表面表达的糖蛋白CD1d降解，下调 CD1d 表达也有助于 HPV 感染细胞逃避宿主的免疫监视。

1.4 HPV-16 E5蛋白作为肿瘤治疗的新靶点 从上文描述我们可知，HPV-16 E5蛋白可以通过对多种细胞信号途径的调控促进肿瘤的进程，E5蛋白在病毒周期早期发挥作用，随着后期病毒DNA的整合，E5基因会发生缺失，因此，如果将E5蛋白作为宫颈癌治疗的新靶点的话可以从早期控制病损的进展。动物实验表明注射重组腺病毒 HPV-16 E5疫苗或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)E5肽和CpG寡核苷酸可显著降低肿瘤的生长，这是由于机体是通过 CD8与CTL 介导的细胞免疫对HPV引起的疾病进行最有效的免疫应答[22]。关于HPV-16 E5作为宫颈癌治疗的靶基因有很多假设，有学者认为通过阻断E5的细胞融合作用，可控制早期肿瘤的发展；也有人认为可以仿照小干扰 RNA (siRNA)对 E6和E7 基因的沉默或干扰来抑制E5的功能。另外，在体外向HPV-16 E5感染的癌细胞转染溶瘤腺病毒并结合放射治疗，可明显抑制细胞的生长，诱导细胞凋亡[23]。针对E5蛋白功能域N端设计的模拟肽可与E5蛋白竞争结合细胞靶蛋白，已证实针对人类表皮生长因子受体2(HER2)和VEGF 的模拟肽段可有效降低乳腺肿瘤生长[24-25]。

2 HPV-16 E5与E6、E7的相互作用

之前就有研究发现E5有增强E6、E7永生化的潜能，这可能与E5通过抑制p21的表达及促进调节E6/E7表达的重要转录因子AP-l组成成员(c-jun、jun-B和c-fos等)的表达有关，因为它们能在E6、E7介导的转化中起增强或补充性作用。最新的一项关于E5转基因鼠的研究也证明了这一点，Maufort等[26]用雌激素处理E5转基因小鼠6个月后，小鼠出现严重的宫颈上皮新生物，E5基因与E6或E7基因联合诱导的宫颈新生物比单独E5基因诱导作用强。Hu等[27]研究表明，HPV-16 E5可导致细胞之间融合产生双核细胞，低危型HPV-6 E5则不能诱导细胞融，HPV-16 E5与E6和E7共表达时能促进这些双核细胞繁殖，也能增加双核细胞的形成率，以此我们可以认为E5在肿瘤的早期发挥作用，而在肿瘤的发展的后期阶段则需要E6和E7的协助。Boulenouar等[28]发现E5和E6、E7共同作用下能减弱钙黏蛋白(E-cadherin)的表达，而钙黏蛋白的下调是恶性肿瘤进展的标志。另外，E5也可与单独E6或E7互助。之前就有学者证实E5与E7的协调作用能刺激细胞的增值。E5有改变细胞重要的形态学和使肌动蛋白细胞骨架重组的潜能，与E6协同作用作用可诱导挖空细胞的形成，挖空细胞是HPV感染后光学显微镜下可见的特异性细胞[29]。有人认为宫颈癌中p21基因的下调可能是E5和E6的协同作用，但E6 蛋白可导致P53降解从而促进恶性转化，而p53可以活化p21基因表达，关于HPV病损中p21基因表达的抑制是否依赖P53现未得到证实，所以关于E5和E6的协同下调p21基因的表达仍需要进一步的研究[30]。

3 结语

虽然关于HPV-16 E5基因是否在HPV DNA整合的后期发生缺失现仍存在争议，但利用HPV-16 E5疫苗治疗早期宫颈癌可作为一种新的治疗手段。尽管E5蛋白在细胞中的表达水平较低，但对其细胞的转化作用及与E6、E7的互助的研究也为HPV感染的病损的治疗提供了依据。遗憾的是，目前关于HPV-16 E5蛋白致癌性机制尚未完全明确，E5蛋白是否在肿瘤进展的整个周期里都有表达，E5蛋白主要是通过什么机制促进E6、E7蛋白的永生化，以及E5蛋白疫苗能否应用到头颈部肿瘤的治疗，这些仍需要进一步的研究。

[1] Rosales R,Rosales C.Immune therapy for human papillomaviruses-related cancers[J].World J Clin Oncol，2014,5(5):1002-1019.

[2] Sdek P,Zhang ZY,Cao J,et al.Alteration of cell-cycle regulatory proteins in human oral epithelial cells immortalized by HPV16 E6 and E7[J].Int J Oral Maxillofac Surg,2006,35(7):653-657.

[3] Narisawa-Saito M,Kiyono T.Basic mechanisms of high-risk human papillomavirus-induced carcinogenesis:roles of E6 and E7 proteins[J].Cancer Sci,2007,98(10):1505-1511.

[4] DiMaio D,Mattoon D.Mechanisms of cell transformation by papillomavirus E5 proteins[J].Oncogene,2001,20(54):7866-7873.

[5] Sahab Z,Sudarshan SR,Liu X,et al.Quantitative measurement of human papillomavirus type 16 e5 oncoprotein levels in epithelial cell lines by mass spectrometry[J].J Virol,2012,86(17):9465-9473.

[6] Kim MK,Kim HS,Kim SH,et al.Human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein as a new target for cervical cancer treatment[J].Biochem Pharmacol,2010,80(12):1930-1935.

[7] Lewis C,Baro MF,Marques M,et al.The first hydrophobic region of the HPV16 E5 protein determines protein cellular location and facilitates anchorage-independent growth[J].Virol J,2008,5(1):30.

[8] Ganguly N.Human papillomavirus-16 E5 protein:oncogenic role and therapeutic value[J].Cell Oncol,2012,35(2):67-76.

[9] Dannenberg AJ,Lippman SM,Mann JR,et al.Cyclooxygenase-2 and epidermal growth factor receptor:pharmacologic targets for chemoprevention[J].J Clin Oncol,2005,23(2):254-266.

[10] Genther Williams SM,Disbrow GL,Schlegel R,et al.Requirement of epidermal growth factor receptor for hyperplasia induced by E5,a high-risk human papillomavirus oncogene[J].Cancer Res,2005,65(15):6534-6542.

[11] Suprynowicz FA,Krawczyk E,Hebert JD,et al.The human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein inhibits epidermal growth factor trafficking independently of endosome acidification[J].J Virol,2010,84(20):10619-10629.

[12] Crusius K,Rodriguez I,Alonso A.The human papillomavirus type 16 E5 protein modulates ERK1/2 and p38 MAP kinase activation by an EGFR-independent process in stressed human keratinocytes[J].Virus Genes,2000,20(1):65-69.

[13] Pedroza-Saavedra A,Lam EW,Esquivel-Guadarrama F,et al.The human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein synergizes with EGF-receptor signaling to enhance cell cycle progression and the down-regulation of p27(Kip1)[J].Virology,2010,400(1):44-52.

[14] Hu LL,Potapova TA,Li SB,et al.Expression of HPV16 E5 produces enlarged nuclei and polyploidy through endoreplication[J].Virology,2010,405(2):342-351.

[15] Brandsma JL,Sun Y,Lizardi PM,et al.Distinct human papillomavirus type 16 methylomes in cervical cells at different stages of premalignancy[J].Virology,2009,389(1/2):100-107.

[16] Piyathilake CJ,Macaluso M,Alvarez RD,et al.A higher degree of methylation of the HPV 16 E6 gene is associated with a lower likelihood of being diagnosed with cervical intraepithelial neoplasia[J].Cancer,2011,117(5):957-963.

[17] Kabsch K,Alonso A.The human papillomavirus type 16 E5 protein impairs TRAIL-and FasL-mediated apoptosis in HaCaT cells by different mechanisms[J].J Virol,2002,76(23):12162-12172.

[18] Oh JM,Kim SH,Cho EA,et al.Human papillomavirus type 16 E5 protein inhibits hydrogen peroxide-induced apoptosis by stimulating ubiquitin-proteasome-mediated degradation of Bax in human cervical cancer cells[J].Carcinogenesis,2010,31(3):402-410.

[19] Campo MS,Graham SV,Cortese MS,et al.HPV-16 E5 down-regulates expression of surface HLA class I and reduces recognition by CD8 T cells[J].Virology,2010,407(1):137-142.

[20] Vigneron N,Van den Eynde BJ.Insights into the processing of MHC class I ligands gained from the study of human tumor epitopes[J].Cell Mol Life Sci,2011,68(9):1503-1520.

[21] Miura S,Kawana K,Schust DJ,et al.CD1d,a Sentinel Molecule Bridging Innate and Adaptive Immunity,Is Downregulated by the Human Papillomavirus(HPV) E5 Protein:a Possible Mechanism for Immune Evasion by HPV[J].J Virol,2010,84(22):11614-11623.

[22] Liao SJ,Deng DR,Zeng D,et al.HPV16 E5 Peptide vaccine in treatment of cervical cancer in vitro and in vivo[J].J Huazhong Univ Sci Technol,2013,33(5):735-742.

[23] Wang W,Sima N,Kong DB,et al.Selective targeting of HPV-16 E6/E7 in cervical cancer cells with a potent oncolytic adenovirus and its enhanced effect with radiotherapy in vitro and vivo[J].Cancer Lett,2010,291(1):67-75.

[24] Foy KC,Liu ZZ,Phillips G,et al.Combination Treatment with HER-2 and VEGF Peptide Mimics Induces Potent Anti-tumor and Anti-angiogenic Responses in Vitro and in Vivo[J].J Biol Chem,2011,286(15):13626-13637.

[25] Foy KC,Miller MJ,Moldovan N,et al.Combined vaccination with HER-2 peptide followed by therapy with VEGF peptide mimics exerts effective anti-tumor and anti-angiogenic effects in vitro and in vivo[J].Oncoimmunology,2012,1(7):1048-1060.

[26] Maufort JP,Shai A,Pitot HC,et al.A Role for HPV16 E5 in Cervical Carcinogenesis[J].Cancer Res,2010,70(7):2924-2931.

[27] Hu L,Plafker K,Vorozhko V,et al.Human papillomavirus 16 E5 induces bi-nucleated cell formation by cell-cell fusion[J].Virology,2009,384(1):125-134.

[28] Boulenouar S,Weyn C,Van Noppen M,et al.Effects of HPV-16 E5,E6 and E7 proteins on survival,adhesion,migration and invasion of trophoblastic cells[J].Carcinogenesis,2010,31(3):473-480.

[29] Krawczyk E,Suprynowicz FA,Liu X,et al.Koilocytosis:a cooperative interaction between the human papillomavirus E5 and E6 oncoproteins[J].Am J Pathol,2008,173(3):682-688.

[30] Liao S,Deng D,Hu X,et al.HPV16/18 E5,a promising candidate for cervical cancer vaccines,affects SCPs,cell proliferation and cell cycle,and forms a potential network with E6 and E7[J].Int J Mol Med,2013,31(1):120-128.

国家自然科学基金资助(81172574)；皖南医学院人才引进科研启动资金资助

项先旺，硕士在读，Email：drx8807@163.com

陈传俊，主任医师，硕士生导师，Email：ccj6318@sina.com

R373.9

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2015.05.038

2015-03-03)