大黄素联用吉西他滨对胰腺癌细胞Bxpc-3裸鼠移植瘤的抑制作用

魏为添，刘殿雷

（1.浙江省肿瘤医院肿瘤外科，杭州 310000；2.杭州市中医院）

大黄素联用吉西他滨对胰腺癌细胞Bxpc-3裸鼠移植瘤的抑制作用

魏为添1，刘殿雷2

（1.浙江省肿瘤医院肿瘤外科，杭州 310000；2.杭州市中医院）

目的探讨大黄素增强吉西他滨对胰腺癌细胞Bxpc-3裸鼠移植瘤的促凋亡作用及其可能的作用机制。方法在培养人胰腺癌Bxpc-3细胞的基础上建立荷瘤模型，荷瘤裸鼠用随机区组设计分配方法分为四组：0.9%氯化钠注射溶液组（N组）：腹腔注射0.9%氯化钠注射溶液0.2 mL，大黄素组（E组，40 mg／kg），吉西他滨组（G组，125 mg／kg），联合组（E+G组，大黄素40 mg／kg和吉西他滨80 mg／kg）。用药均采用腹腔注射。用药过程观测裸鼠体质量、肿瘤体积和瘤重的变化。用免疫组织化学染色法来检测移植瘤组织中凋亡相关蛋白NF-κB、Bcl-2和Active caspase 3表达的变化。结果给药结束后，吉西他滨组的裸鼠平均体质量和对照组相比显著减小，而联合组中裸鼠平均体质量和对照组相比差异无统计学意义；联合组移植瘤平均体积和瘤重均明显比其他组小；E+G组的NF-κB、Bcl-2的表达与其余各组比较均明显降低，联合组中的Active caspase 3的表达和其余各组相比明显增多。结论大黄素可显著提高吉西他滨对Bxpc-3胰腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用，其作用机制可能为大黄素抑制凋亡抑制基因NF-κB、Bcl-2的表达从而促进胰腺癌细胞的凋亡。

胰腺肿瘤；细胞凋亡；大黄素；抗肿瘤药；小鼠，裸

图1 本研究材料和方法中所描述的实验方案示意图

图2 各组肿瘤平均体积变化曲线

图4 末次给药后1周各组瘤体中NF-k B、Bcl-2和Active caspase-3的表达变化(免疫组织化学染色法,1O×4O)

胰腺癌起病隐匿，早期诊断困难，90%的患者确诊时已是晚期，外科手术切除率低。目前化学药物治疗是临床上治疗胰腺癌的主要重要手段之一。吉西他滨仍被认为是晚期胰腺癌标准治疗药物，但是许多研究显示吉西他滨单药的疗效有限，且有明显副作用。大黄素（1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌，EM）是一种蒽醌类物质，研究表明大黄素能抑制多种恶性肿瘤细胞生长并诱导凋亡［1-3］。本研究旨在探讨动物体内大黄素联合吉西他滨对荷瘤裸鼠胰腺癌细胞的促凋亡作用并探讨两药联合使用的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人胰腺癌Bxpc-3细胞株购自美国组织培养库（ATCC），BXPC-3细胞培养于37℃含5% CO2、37℃培养箱中，使用含10%胎牛血清、100 u／mL青霉素和100 u／mL链霉素的RPMI1640，细胞单层贴壁生长至70%～80%融合时胰蛋白酶消化传代。实验动物为6～7周龄BALB／c nu／nu雌性裸小鼠（体质量20～22 g），购自中国科学院上海实验动物中心，SPF级环境饲养。大黄素（批号：E7881）购自美国sigma公司。吉西他滨（批号：A629519A）购自法国礼来公司。兔抗人NF-κB多克隆抗体、兔抗人BCL-2多克隆抗体和兔抗人Active caspase 3多克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 胰腺癌荷瘤裸鼠模型建立和实验方案 将Bxpc-3细胞悬液注射于裸小鼠背部靠近后肢部位皮下，每只鼠约注射2×106个细胞。3周后，待裸鼠移植瘤长径均≥5 mm后，以移植瘤长短径计算瘤体相似体积。按肿瘤体积的大小来顺排，用随机区组设计分配方法将裸鼠分为4组，分别为对照组（N：注射0.9%氯化钠注射溶液）、大黄素组（E组：40 mg／kg）、吉西他滨组（G组：125 mg／kg）和联合组（E+G组：吉西他滨80 mg／kg+大黄素40 mg／kg），每组12只。分组后经腹腔注射给药，3 d／次，总共11次，用药结束后1周即用药开始后第37天时将裸鼠处死。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型的测量与处理 从用药开始6 d测量一次裸鼠的体质量，每次以临用药前所测体质量进行用药，同时以游标卡尺测量皮下移植瘤的大小，包括长径a和短径b（mm），计算皮下移植瘤的相似体积，体积（V）＝4／3×π×r3，r＝（a+ b）／4。裸鼠处死之前检测瘤体体积和裸鼠体质量，共测7次瘤体体积和裸鼠体质量。抑瘤率＝［1-（治疗组分组时平均瘤体体积 -实验结束后平均瘤体体积）／（对照组分组时平均瘤体体积-实验结束后平均瘤体体积）］×100%。绘制各组裸鼠体质量的变化曲线和瘤体体积的变化曲线。处死裸鼠后剥取瘤块以称取瘤重和拍照，比较治疗后肿瘤大小。

1.2.3 免疫组织化学染色法检测凋亡相关蛋白NF-κB、Bcl-2和Active caspase-3的表达 常规固定、包埋后，取石蜡切片脱蜡水化，按照免疫组织化学二步法试剂盒所示操作步骤进行染色，图片结果在显微镜下拍照后，采用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件来进行分析平均吸光度。

1.3 统计学处理 所有数据用SPSS 17.0软件ANOVA方差分析进行统计分析。

2 结果

2.1 各组裸鼠体质量变化 从开始用药当天开始每6天测量1次裸鼠体质量，末次用药后1周再测量1次，前后共测量7次（图1）。末次用药后1周，各组裸鼠平均体质量大小为：E组［（17.3±0.57）g］＞N组［（17.1±0.48）g］＞E+G组［（16.5± 0.39）g］＞G组［（13.2±0.41）g］，G组与其他各组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），其余三组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组平均瘤体体积（图2，3）、瘤重及抑瘤率裸鼠分组时各组裸鼠的平均瘤体体积是（0.40±0.09）cm3，各组间差异无统计学意义。末次给药后1星期，检测并计算各组平均瘤体及瘤重大小：对照组平均瘤体体积是（2.19±0.16）cm3；瘤重（2.23±0.27）g。大黄素组平均瘤体体积是（1.66±0.11）cm3，瘤重（1.76±0.20）g抑瘤率是30.7%。吉西他滨组的瘤体平均体积为（1.18± 0.12）cm3，瘤重（1.24±0.12）g，抑瘤率是57.6%。联合组平均瘤体体积为（0.53±0.08）cm3，瘤重（0.56±0.08）g，抑瘤率是93.9%。和对照组比较，吉西他滨组与大黄素组的平均瘤体体积和瘤重均明显小于对照组（P＜0.05），但联合组抑制肿瘤的作用更为明显，和其余各组相比，其差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 免疫组织化学分析大黄素、吉西他滨对裸鼠移植瘤BXPC-3细胞中凋亡相关的蛋白NF-κB、Bcl-2、Active caspase-3表达的影响（图4） 末次给药后一周剖取裸鼠移植瘤组织，经用免疫组织化学法染色后测量各组瘤体组织平均吸光度，见对照组瘤体细胞质有大量NF-κB、Bcl-2阳性表达；吉西他滨组中NF-κB、Bcl-2的阳性表达比对照组稍增多，但无显著性差异（P＞0.05），而大黄素组（E组）Bcl-2阳性表达较对照组明显变少（P＜0.05）；而联合组（E +G组）中NF-κB、Bcl-2的阳性表达比对照组与吉西他滨组均要明显减少（P＜0.05）。

3 讨论

细胞凋亡的受阻和肿瘤发生、发展有很密切的关系。通过诱导肿瘤细胞的凋亡、提高肿瘤对化疗药物治疗的敏感性乃是目前治疗恶性肿瘤的一个重要治疗策略。Guo［2］、Cai［4］等人通过研究发现大黄素有诱导胰腺癌肿瘤细胞发生凋亡的效果。而Caspase家族在介导细胞凋亡过程中起重要作用，其中Caspase为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。本实验采用免疫组织化学法检测了四组标本中活化的Caspase-3（17KD），结果显示，大黄素和吉西他滨都能使Active Caspase-3（17KD）表达增多，联合用药时Active Caspase-3（17KD）表达比单独用药均显著增多，提示联合用药使Caspase-3激活而使更多的肿瘤细胞进入凋亡阶段。

腺癌中存在NF-κB的表达和激活，并认为NF-κB的表达是胰腺癌化疗耐药的原因之一［5-7］。本实验表明胰腺癌中存在NF-κB的表达。抑制NF-κB的表达能增强多种化疗药物的抗肿瘤作用［8-9］。Fahy等［10］研究发现，吉西他滨能上调NF-κB和其调控的Bcl-2启动因子活性，因为活化的NF-κB促进有丝分裂和抗凋亡，进而引起胰腺癌细胞对吉西他滨的耐药。因此，吉西他滨耐药与NF-κB和其下游基因产物Bcl-2过表达相关，提示NF-KB是逆转耐药的靶点。研究表明大黄素可下调细胞NF-κB表达［11-12］。本研究发现，吉西他滨可使胰腺癌NF-κB表达增加，但与对照组相比差异无统计学意义，这可能与吉西他滨用药时间仍然较短有关，但大黄素、大黄素联合吉西他滨显著下调胰腺癌中NF-κB的表达，提示大黄素可能通过抑制NF-κB的表达，而发挥对胰腺癌细胞促凋亡作用。Bcl-2是NF-κB的靶基因，Kunnumakkara［13］、Kong［14］等均报道可以通过NF-κB的下调而使Bcl-2下调。本研究发现，吉西他滨可使胰腺癌中Bcl-2表达增加，但与对照组相比差异无统计学意义，而大黄素组明显下调移植瘤细胞Bcl-2表达；大黄素可能通过下调胰腺癌细胞NF-κB表达，从而下调Bcl-2，通过Caspase级联反应最后促使Caspase-3的激活，从而导致癌细胞凋亡增多，达到增强吉西他滨对sw1990细胞移植瘤的促凋亡作用。

吉西他滨用于胰腺癌化疗时毒副作用较强。本实验发现用药结束后吉西他滨治疗后荷瘤裸鼠体质量与其他各组相比均显著下降，差异有统计学意义，而大黄素与吉西他滨联合组裸鼠体质量较吉西他滨治疗组大，提示在降低吉西他滨用剂量的基础上，联用大黄素能增加疗效并减少毒副作用。

本实验表明，大黄素联用吉西他滨能增加吉西他滨对胰腺癌裸鼠移植瘤的抑瘤作用，其机制与大黄素可下调凋亡相关蛋白NF-κB、Bcl-2的表达来增加吉西他滨对胰腺癌细胞的促凋亡作用有关。

（本文图1～4见插图6-1）

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Emodin enhances gem citabine-induced apoptosis in pancreatic cancer model of Bxpc-3 cell xenograft in nude mice through the downregulation of Bcl-2

WEIWeitian，LIU Dianlei（Department of General Surgery，Zhejiang Cancer Hospital，Hangzhou 310000，China）

LIU Dianlei，Email：ldl0304＠163.com

ObjectiveTo investigate the enhanced gemcitabine-induced apoptosis by emodin and the possible therapeuticmechanism.MethodsHuman pancreatic carcinoma Bxpc-3 cellswere cultured and themurine xenograftmodel bearing human pancreatic carcinoma was established.Then the mice were randomly divided into control group，emodin group，gemcitabine group and emodin combined with gemcitabine group.Body weightofmice、the tumor volume and tumor weightweremeasured during the study.And Immunohistochemistry（IHC）was used to detect the variance of the apoptotsis relative protein expression such as NF-κB、Bcl-2 and Active caspase 3.ResultsAfter the last administrations，the average weight of nudemice in gemcitabine group decreased significantly compared with the control group，and the nudemiceweight in the combined therapy group had no significant decrease compared with the control group.And themean tumor volume and tumor weight in combined administration group was significantly decreased compared to the other groups.Immunohistochemistry（IHC）analysis showed the expression of NF-κB、bcl-2 proteins was significantly decreased in the combined administration group compared to the other gourps.Active caspase 3 was significantly increased compared to the other gourps.ConclusionEmodin can enhance the antitumor effect of gemcitabine in the growth of the xenografts of human pancreatic cancer Bxpc-3 cells in nude mice，whose mechanismsmay be related to the downregulation of NF-κB and Bcl-2.

Pancreatic neoplasms；Apoptosis；Emodin；Antineoplastic agents；Mice，nude

R735.9

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.06.019

2014-09-30）

浙江省中医药优秀青年人才基金资助项目（2013ZQ026）

魏为添，医师，Email：wwtlhy＠163.com

刘殿雷，医师，Email：ldl0304＠163.com