肝豆灵干预铜负荷大鼠肾损伤的代谢组学研究*

蒋怀周，王 键，许晶晶，董继扬

（1.安徽中医药大学中医临床学院，安徽 合肥230031；2.厦门大学电子科学系，福建省等离子体与磁共振研究重点实验室，福建 厦门361005）

Wilson 病（Wilson disease，WD）是一种常染色体隐性遗传性疾病，由英国神经病学家Samuel Alexander Kinnier 在1912 年首次描述而得名。该病患者由于ATP7B 基因缺陷，导致机体合成铜蓝蛋白障碍、胆汁排铜减少，铜离子沉积于各组织器官[1]。若铜沉积于肾脏，可致肾小管损伤，重吸收功能发生障碍，引起相应临床表现。

中医药治疗本病具有一定的优势，其中，肝豆灵片以肝豆汤为基本方优化组合而成，是安徽省中医院院内制剂，被应用于临床已有40 年历史[2-3]，临床实践及科研实验证明本方对WD 具有一定的排铜和治疗作用[4-5]。本实验以代谢组学方法对肝豆灵干预的铜负荷大鼠肾组织进行研究，期望从小分子代谢角度，探讨肝豆灵的肾脏排铜机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

硫酸铜（上海国药集团）；乙醚（上海苏懿化学试剂有限公司）；TUNEL 试剂盒（美国Roche 公司）；甲醇（国药集团化学试剂有限公司）；三氯甲烷（国药集团化学试剂有限公司）。

1.2 实验动物

SPF 级雄性Wistar 大鼠，3 月龄，体质量（200±20）g，实验动物许可证号：SCXK（皖）2011-002，由安徽医科大学实验动物中心提供，饲养于安徽中医药大学省部共建教育部重点实验室。

1.3 实验仪器

石蜡切片机（安徽合肥电子研究所）；病理图像分析仪（武汉清平影像技术有限责任公司）；Beckman 离心机（美国Beckman 公司）；移液器（德国Eppendorf 公司）；显微镜（日本Olympus 公司）；高通量组织研磨器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；冷冻干燥机（北京博医康试验仪器有限公司）；布鲁克600MHz 核磁共振谱仪（德国布鲁克公司）。

1.4 动物模型制备

造模过程中，正常组始终自由饮水摄食，模型组和肝豆灵组以铜负荷法[6]复制模型大鼠：连续12周喂饲含硫酸铜的饲料（1g/kg）和水（0.185%）。自第7 周开始，每日1 次，以肝豆灵灌胃肝豆灵组大鼠，药物灌胃剂量为0.486g/kg；模型组和肝豆灵组以等容量生理盐水灌胃。依据文献[7]，若偏最小二乘判别分析（PLS-DA）得分图中，3 组大鼠分别处于不同区域，且组内较为聚集，说明3 组大鼠代谢有差异，造模成功。造模过程中，去除不明原因死亡大鼠，剩余大鼠为正常组8 只，模型组10 只，肝豆灵组17 只。

1.5 样本采集

造模结束后，将大鼠乙醚吸入麻醉，取新鲜肾组织，一份以液氮速冻后，置于超低温冰箱-80℃保存，以备NMR 检测；另一份从每组随机取6 个样品，以10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，待测肾小管上皮细胞凋亡情况。

2 实验方法

2.1 细胞凋亡检测

结合文献[8]，参照Roche 公司TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒说明书操作实验。正常肾小管上皮细胞核呈蓝色，阳性细胞（凋亡细胞）核呈棕褐色者。每张片随机取3 个肾小管视野，计算肾小管上皮细胞凋亡指数（Apoptosis Index，AI），计算方法：AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%. 以SPSS19.0 统计软件分析所得数据，实验结果计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.2 肾组织提取

将所取肾组织加入由甲醇和蒸馏水配置的溶液里，低温匀浆；加氯仿漩涡；加蒸馏水漩涡；低温高速（4℃，10 000r/min）离心样品；所得上清液移至离心管；真空干燥箱抽干甲醇；冻干机中将剩余液体冻干成粉末，保存于超低温冰箱-80℃。

2.3 1H NMR 谱采集

常温解冻粉末样品，加入含TSP 的重水配置的磷酸盐缓冲液震荡；低温离心（4℃，10 000r/min）10min，取上清液转移至核磁管内。以Bruker 600MHz谱仪核磁采样，实验温度296K。预饱和脉冲序列ZGPR（RD-90°-ACQ）采集1H NMR 谱，谱宽12kHz，弛豫延时2s，采样点数32K，累加次数64 次。

2.4 1H NMR 谱图处理

MestreNova 9.0 软件打开fid 数据，傅里叶变换为NMR 谱。以TSP 谱峰为零点定标NMR 谱，相位校正和基线校正NMR 谱，以自编软件进行谱峰对齐，截去残余水信号和甲醇信号后，对剩余区域进行分段积分。对所得数据进行概率商归一化（PQN）[9]，将数据导入SIMCA-P 软件（version 14.0，Umetrics，Sweden）进行多变量分析。

3 结果

3.1 肾小管上皮细胞凋亡结果

肾小管上皮细胞凋亡检测结果如图1 所示：正常组肾小管上皮细胞凋亡较少，呈散在分布；与正常组相比，模型组上皮细胞凋亡指数增多（P＜0.01）；与模型组相比，肝豆灵组上皮细胞凋亡指数减少（P＜0.01），见表1。

图1 肾小管上皮细胞凋亡（TUNEL，×400）

表1 3 组大鼠肾小管上皮细胞凋亡指数

3.2 代谢轮廓分析

大鼠肾组织典型1H NMR 谱见图2。参照相关文献[10-11] 和HMDB 数据库（http：//www.hmdb.ca），将代谢物作出如下归属：

为了分别分析3 组代谢物之间的差异，我们对样品预处理后的数据进行PLS-DA 分析。根据PLS-DA 得分图里点的聚集情况可以判断样品类别差异，本实验3 组样品分别在得分图（图3）中处于不同区域，说明样品间存在代谢差异。R2X、R2Y 和Q2是所建立模型的质量评价指标，交叉核实参数Q2是模型的累积预测程度，可反映预测结果的真实性，Q2>0.4 时模型的预测结果可通过[12]，而本实验正常组-模型组-肝豆灵组、正常组-模型组、模型组-肝豆灵组的Q2分别为0.939，0.977，0.942。对本实验样品的PLS-DA 模型进行200次的排列实验，如图4 所示，正常组-模型组、模型组-肝豆灵组模型的解释能力R2和预测能力Q2拟合线斜率大于0，提示它们在PLS-DA 模型得分图的区分并非偶然，模型有效，验证通过，结合本实验细胞凋亡结果，说明造模成功[7]，药物干预有效。

图2 3 组大鼠肾组织的典型1H NMR 谱

图3 肾组织样品的PLS-DA 得分图

图4 肾组织样品的PLS-DA 模型验证图

根据代谢物谱峰在PLS-DA 模型的VIP 值、回归系数值以及t 检验结果，我们发现了一些对3 组组间差异贡献较大的代谢物，并将这些差异代谢物列入表2。

4 讨论

肾脏是机体代谢最重要的器官之一，通过尿液的生成和排泄，它可以排出人体大部分的代谢最终产物，调节人体水、电解质和酸碱平衡，维持机体内环境相对稳定。WD 患者肾组织铜含量约比正常人高10 倍左右，由于肾小管上皮细胞的特殊结构和功能，铜主要沉积在WD 患者肾脏近端小管、远端小管，肾小球囊亦有铜粒沉着。光镜下可见患者近端肾小管上皮细胞扁平化、基底膜增厚、刷状缘消失，部分远端小管上皮轻度脂肪变性，肾小球毛细血管管腔狭窄或者闭塞。随着病情加重，患者可出现肾小管重吸收功能障碍，临床表现为肾性糖尿、蛋白尿和氨基酸尿等，少数患者可发生肾小管性酸中毒、肾病综合征等[13]。本实验模型组大鼠肾组织细胞凋亡指数增高，肝豆灵组大鼠肾组织细胞凋亡指数降低，说明铜负荷造模对大鼠肾脏造成了一定的损伤，而肝豆灵可有效抑制铜负荷所导致的肾损伤。

表2 大鼠肾组织特征代谢物

肝豆灵主要由大黄、黄连、黄芩、半枝莲、穿心莲、萆薢、泽泻、金钱草等组成。其中，大黄清热通腑，荡涤热结，黄连、黄芩、半枝莲、穿心莲苦寒清热，泻火解毒，萆薢、泽泻、金钱草泻热通淋、利湿祛浊。以上诸药合用，可起到清热解毒，通腑利尿的作用，不仅能够促进尿铜的排泄，还可以促进铜从其正常渠道胆汁排出。以肝豆灵治疗WD 肾损伤患者，发现本方可降低患者的尿微量蛋白含量，提示肝豆灵对WD 肾损伤具有一定的干预作用[14]。本方的君药是大黄，现代医学发现，以大黄水煎剂干预慢性肾功能衰竭大鼠，可降低模型大鼠血清肌酐和尿素氮水平，改善肾性贫血症状，纠正钙、磷、镁等电解质代谢紊乱和酸中毒，改善蛋白质代谢紊乱，对肾小管损伤有一定的保护作用[15]。在同样是金属中毒所致的肾损伤研究中发现，大黄的有效成分大黄酸可降低镉中毒所引起的氧化应激反应，减轻亚慢性镉中毒小鼠的肾损伤[16]。本方其他成分如半枝莲具有抗氧化活性，能够减轻小鼠肾脏氧化应激所致细胞凋亡[17]，黄连[18]、黄芩[19]、萆薢[20]、金钱草[21]、泽泻[22]对多种肾脏损伤具有不同角度的干预作用。

本实验以肝豆灵干预铜负荷模型大鼠，结果显示模型大鼠苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸、亮氨酸、肌苷、天冬氨酸含量降低，给予肝豆灵干预后，这些小分子含量有所恢复。

苯丙氨酸和酪氨酸属于芳香族氨基酸，苯丙氨酸羟化酶可催化苯丙氨酸生成酪氨酸。肾脏与芳香族氨基酸的合成、分解和排泄密切相关，是体内芳香族氨基酸代谢的主要器官之一[23]，也是苯丙氨酸转化为酪氨酸的一个重要场所[24]。文献报道通过测芳香族氨基酸含量，可以帮助探知肾损伤情况[25-26]。在代谢组学研究中亦发现，肾损伤时芳香族氨基酸含量具有一定的改变[16，27]，本实验模型组大鼠肾组织苯丙氨酸和酪氨酸含量发生了变化，与以上研究结果相符。经肝豆灵干预后，大鼠这两种氨基酸含量有所恢复，说明肝豆灵对铜负荷肾损伤的干预可能涉及芳香族氨基酸的代谢。

亮氨酸和缬氨酸属于支链氨基酸，是人体必需氨基酸，它们作为氮的载体，在维持机体氮平衡和蛋白质代谢中发挥着重要的作用。临床上对于肾损伤的患者，可补充支链氨基酸，增加体内蛋白合成，降低血尿素氮水平，有助于恢复病人的体能，是肾损伤病人重要的支持治疗手段[28-29]。以基因组学和蛋白质组学研究纳米铜对肾脏的影响，发现铜染毒大鼠肾损伤涉及支链氨基酸的异常降解[30]。对模型小鼠狼疮性肾炎研究发现，中成药昆仙胶囊可升高模型小鼠异常降低的支链氨基酸水平，可能是该药的治疗作用途径之一[31]。以上研究结果提示，肾损伤可能与支链氨基酸代谢具有一定的联系。本实验模型组亮氨酸和缬氨酸含量降低，经肝豆灵干预后其含量回升，提示肝豆灵可能通过调节支链氨基酸的代谢，帮助维持机体氮的平衡，干预铜过量对肾脏的损伤。

谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸是参与氨代谢的重要氨基酸，氨在肾脏的代谢主要由肾小管上皮细胞完成。肝豆灵干预后，大鼠肾组织谷氨酸、丙氨酸和天冬氨酸含量向正常范围恢复，且肾小管上皮细胞凋亡指数较模型组有所降低，可能提示肝豆灵对氨的代谢具有调节作用，或许与抑制肾小管上皮细胞凋亡具有一定联系。

本实验中，我们以核磁共振代谢组学方法分析肝豆灵干预铜负荷大鼠后，大鼠肾组织小分子代谢物的变化，发现肝豆灵对铜负荷大鼠肾损伤具有一定的干预作用，其机制可能涉及对芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）、支链氨基酸（亮氨酸、缬氨酸）的调节；抑制肾小管上皮细胞凋亡、调节肾脏氨的代谢。本结果可为临床对WD 患者的肾损伤治疗提供一定的机制参考。

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