LC-MS/MS 法测定注射剂中来自生产管路中的PFOA 和PFOS 的迁移量

张晓芸，张建茹，崔 萍，昝艳楠，曹庆丰，丁逸梅，*

1 南京工业大学江苏省药物研究所，南京 210009；2 南京工业大学药学院，南京211816

注射剂生产管路常选用材质为聚四氟乙烯，其具有耐酸、耐碱及高度的化学稳定性[1]，聚四氟乙烯在聚合生产时添加全氟辛酸（PFOA）等含氟类化合物，含氟系列产品经化学或生物降解最终产生全氟辛基磺酸（PFOS）。PFOA 和PFOS 具有多种毒性，包括生殖毒性、诱变毒性、发育毒性和神经毒性，且在生物体内储蓄难以代谢。在注射液制备工艺中当注射液流经聚四氟乙烯管路或密封件时，PFOA 和PFOS 可能会被溶出迁移至注射液中，且药液与管路的接触面积、接触时间较难评估，因此直接考察注射液药品中PFOA 和PFOS 的迁移量尤为重要。

PFOA 和PFOS 的检测手段目前有如下几种：

②GC/MS 法：PFOA 和PFOS 为强酸性，挥发性较小，吕刚等[9]以乙酰氯为衍生化试剂得到PFOA甲酯和全氟葵酸（PFDA）甲酯测定PFOA；魏琳琳[10]，用碳基固体酸作衍生化试剂，N，N’-二环己基碳二亚胺（DCC）为脱水剂，生成PFOA 甲酯。夏静芬等[11]以2，4-二氟苯胺为衍生剂，N，N’-二环己基碳二亚胺（DCC）为脱水剂与全氟羧酸类（PFCAs）形成酰胺衍生产物；张颖等[12]，以四丁基氢氧化铵为衍生化试剂，超声辅助与PFOA 生成铵盐。

③LCMS 或LCMS/MS 法： 高效液相串联质谱法是目前最为广泛应用的检测PFOA 和PFOS 的定量分析方法。在食品及食品包装材料[13，14]、生物组织[15，16]、药品[17]中关于PFOA 和PFOS 的报道较多。

欧盟及美国FDA 明文规定材料及食品包装材料中PFOA 和PFOS 的使用限量，但我国现行法规暂未明文规定PFOA 和PFOS 在药品中的限量。本文依据一般遗传毒性致癌物的SCT 值，即PFOA 和PFOS 在药品中每日摄入总量设定宜低于1.5 μg。

本实验使用LC-MS/MS 法测定注射剂中来自药品生产管路的PFOA 和PFOS 含量，通过标准加入法能够消除注射剂复杂基体效应对PFOA 和PFOS 测定的影响，得到有效数据，从而准确、简便、快速地测定PFOA 和PFOS 的迁移量。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Waters Quattro Micro 三重四极杆质谱仪，Waters 2695 液相色谱仪（沃特斯中国有限公司），含在线真空脱气机、四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、电喷雾离子源（ESI）；Masslynx4.0 数据分析系统；XP105DR 十万分之一电子天平（美国Mettler 公司）。

1.2 药品与试剂

注射用甲磺酸萘莫司他 （规格10 mg，批号：2181202、2181203、2 181204；规格50 mg，批号：2181205、2181206、2190101）；吸入用乙酰半胱氨酸溶液（规格3 mL∶0.3 g，批号：170801、170802、170901）；注射用特利加压素无菌稀释剂 （规格5 mL ∶45 mg，批号：191101、191102、191103）；注射用氨磷汀（规格0.5g，批号：S200107、S200110、S200114A、S200114B、S200114C）；PFOA 对照品 （Sigma-Aldrich 公司，纯度95%，批号：WXBD1156V）；PFOS 对照品（Dr.Ehrenstorfer 公司，批号：1015577）。甲醇（Merck 公司，色谱纯）；乙酸铵（Sigma-Aldrich 公司）；水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 LC-MS 条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱（Kromasil C8，100A 150mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.01 mol·mL-1乙酸铵-乙腈（50∶50）；流速：1.0 mL·min-1，分流进样；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

王荣（1984.05-），女，上海，国家建筑信息模型（BIM）产业技术创新战略联盟助理研究员/经济师，南京工业大学经济与管理学院工程管理专业在职硕士研究生，研究方向：建筑产业现代化，工程建设标准化、建筑信息模型BIM。

2.1.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），负离子模式检测；毛细管电压：3.0kV；锥孔电压：30V；源温：120℃；脱溶剂区温度：350℃，碰撞气（氩气）；压力：1.0×10-4mbar；脱溶剂气流速：400 L·h-1；气帘气流速：50 L·h-1。

2.2 溶液配制

PFOA 对照品溶液： 取PFOA 对照品10 mg，精密称定，置100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL 含PFOA 100 μg 的储备液；精密量取该溶液1.0 mL，置50mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成1 mL 含PFOA 2 μg 的溶液。

PFOS 对照品溶液：取PFOS 对照品10 mg，精密称定，置100 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL 含PFOS 100 μg 的储备液；精密量取该溶液1.0 mL，置50 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成1 mL 含PFOS 2 μg 的溶液。

PFOA 与PFOS 混合对照品溶液： 精密量取PFOA 2 μg·mL-1的对照品溶液、PFOS 2 μg·mL-1的对照品溶液各1.0 mL，置200 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL 含PFOA 与PFOS 的500 ng 混合对照品溶液。

①标准曲线法： 分别精确量取PFOA 和PFOS混合对照品溶液（0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL）置50 mL量瓶中，使用甲醇稀释至刻度，摇匀。此标准溶液系列I 中的PFOA 和PFOS 质量浓度分别为5、10、20、30、50 ng·mL-1。

②标准加入法：A.注射冻干粉末：此标准溶液系列I 中的PFOA 和PFOS 质量浓度分别为5、10、20、30、50 ng·mL-1；取注射用冻干粉末1 瓶，分别精密加入标准曲线溶液5 mL，混合均匀，过滤，此标准溶液系列Ⅱ中的PFOA 和PFOS 质量浓度分别为5、10、20、30、50 ng·mL-1。B.注射液：分别精确量取PFOA和PFOS 混合对照品溶液（0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL）置50 mL 量瓶中，分别加入注射液5 支，使用甲醇稀释至刻度，摇匀。此标准溶液系列Ⅲ中的PFOA 和PFOS 质量浓度分别为5、10、20、30、50 ng·mL-1。空白溶液：取注射用冻干粉末或者注射液，用甲醇稀释至一定倍数，摇匀，作为空白溶液（必要时使用有机尼龙膜过滤）。

2.3 专属性试验

精密量取“2.2”中PFOA 与PFOS 混合对照品溶液、空白溶液各20 μL，注入液相色谱仪测定，结果见图1、图2，由图2 可见，空白溶液对测定无干扰。

2.4 线性及灵敏度试验

将配制好的标准曲线法标准溶液和标准加入法标准溶液，在同样的LC/MS 条件下测定，从而获得PFOA 和PFOS 两种线性。回归方程、相关系数见表1。

结果两种方法的PFOA 和PFOS 工作曲线的相关系数均大于0.999 0。说明标准曲线法和标准加入法的PFOA 和PFOS 浓度与响应均呈线性关系。

在同样的LC/MS 检测条件下，比较标准加入和未加入样品基体的检测限和定量限，见表2。由于样品的基体不同，PFOA 和PFOS 在ESI 源中的响应被抑制或者增敏，其程度与注射剂的基体有关。

表1 PFOA 和PFOS 回归方程与相关系数

表2 PFOA 和PFOS 的检测限和定量限

2.5 回收率试验

2.5.1 注射冻干粉末 精密量取PFOA 和PFOS 混合对照品溶液适量，用甲醇稀释制成每1 mL 中分别含PFOA 和PFOS（5、20、30 ng·mL-1）的溶液；取注射用冻干粉1 瓶，精密加入溶液5 mL，混合均匀，过滤。

2.5.2 注射液 分别精确量取PFOA 和PFOS 混合对照品溶液（0.5、2.0、3.0mL）置50mL 量瓶中，分别加入注射液5 支，使用甲醇稀释至刻度，摇匀。制备成PFOA和PFOS 质量浓度分别为5、20、30 ng·mL-1的溶液。

分别采用标准曲线法和标准加入法，进行回收率试验，结果见表3、表4。

使用标准曲线法PFOA 回收率在60%附近，PFOS的回收率在180%附近，RSD 均小于10%，说明PFOA和PFOS 受样品基体的干扰，但平行性较好；使用标准加入法，PFOA 和PFOS 的回收率均在80%～120%，RSD 均小于10%，得到了有效数据，说明标准加入法能够消除样品基体对PFOA 和PFOS 测定的干扰。

为了验证本试验的设想，选取5 个不同规格的注射剂品种，分别采用标准加入法进行回收率试验，均得到良好的数据，结果见表5。PFOA 回收率在93.49%～110.9%，PFOS 的回收率在 87.57%～101.6%，RSD 均小于10%，结果符合验证要求。

表3 PFOA 回收率试验

表4 PFOS 回收率试验

2.6 样品测定及结果

采用标准加入法测定4 个项目下来自生产管路中迁移的PFOA 和PFOS 的含量，结果均未检出。

3 讨论

3.1 定量离子的选择

PFOA 和PFOS 选用m/z 368.9783 作为PFOA的检测离子；PFOS 选用m/z 498.9298 作为PFOS 的检测离子[17]。

3.2 样品前处理筛选

在注射剂中，PFOA 和PFOS 限度为1.5 μg·d-1，样品可供稀释的倍数限于5 倍或者10 倍，样品溶液中有机物含量较高，干扰PFOA 和PFOS 的检测。选择合适的样品前处理排除干扰，是实验解决问题的关键点。文献报道样品前处理主要有4 种：①固相萃取[18]，成本高，回收率低；②液液萃取[19]，基本采用甲基叔丁基醚为萃取溶剂，操作繁琐，但能够得到较好的回收率。③索氏提取[20]，应用于土壤、食品、生物样品等，常用的溶剂包括：乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷以及甲醇；④柱前衍生化[2-12]，周期较长，操作繁琐。

表5 不同注射剂回收率试验（%）

本实验尝试了液液萃取方式，使用溶剂：正己烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷。PFOA 和PFOS 具有一定的水溶性，萃取效率较低，操作繁琐；后采用甲醇稀释样品，并使用有机尼龙膜过滤。

3.3 标准曲线法和标准加入法比较

本实验先考察标准曲线法，发现PFOA 回收率在60%附近偏低，PFOS 的回收率在180%附近偏高，不符合《中国药典》2015 版通则9101 药品质量标准分析方法“验证指导原则”中验证的要求；后采用标准加入法，结果良好，说明标准加入法可消除注射剂品种复杂基体干扰问题，避免使用操作繁琐的萃取方式，从而准确、简便、快速地测定了注射剂中来自生产管路的PFOA 和PFOS 的迁移量。