利伐沙班原料药中重金属镍残留量的检测方法与评价

江苏省淮安市食品药品检验所，淮安223001

利伐沙班 （Rivaroxaban） 化学名为5-氯-N-（（（5S）-2-氧代-3-（4-（3-氧代-4-吗啉基） 苯基）-1，3-恶唑烷-5-基）甲基）-2-噻吩甲酰胺[1]，分子式为C19H18ClN3O5S，是一种口服的抗凝血药物，它通过高选择性直接抑制Xa 因子达到抑制凝血酶产生和血栓形成的作用，与传统抗凝血药物相比，具有服用方便、起效迅速、安全性高等特点[2]。

在利伐沙班合成中，用到雷尼镍作为催化剂[3]，镍及其盐类的毒性较低，但由于它本身具有生物化学活性，故能激活或抑制一系列的酶（精氨酸酶、羧化酶、酸性磷酸酶和脱羧酶）而发挥其毒性。长期接触（如冶炼镍、镀镍等）、吸入或注射镍化物，均有致癌作用。欧洲药物评审组织（EMEA）将金属催化剂按风险级别分类管理，镍作为第1 类金属，规定注射用原料药中不得超过1 μg·g-1[4]。

药物中镍含量的测定方法主要有火焰原子吸收法、石墨炉原子吸收法、电感耦合等离子体质谱法等。本研究采用微波消解法进行样品前处理，建立了石墨炉原子吸收法、电感耦合等离子体质谱法两种方法测定利伐沙班中残留的镍，并作比较分析，为药物中痕量镍的测定提供参考。

1 石墨炉原子吸收分光光度法测定利伐沙班原料药中镍残留

1.1 仪器与药品、试剂

1.1.1 仪器 安东帕微波消解仪（奥地利安东帕公司）；Aglient 240AAS 原子吸收分光光度计、Aglient PSD120 可编程进样器、镍空心阴极灯（均美国安捷伦公司）；BP211 电子分析天平（德国赛多利斯公司）。

1.1.2 药品与试剂 利伐沙班（某药厂提供）批号为20151001、20151002、20151003、20151004、150401、150402；镍标准溶液（100 μg·mL-1，中国计量研究院，批号：16041）；硝酸；超纯水。

1.2 方法与结果

1.2.1 仪器工作条件 检测波长：232.0 nm，狭缝：0.2 nm；灯电流：4.0 mA；背景校正：塞曼；石墨炉原子吸收光谱仪进样体积为20.0 μL，重复测定次数：3次。石墨炉升温参数见表1。

1.2.2 对照品溶液制备 取镍标准溶液 ［C （Ni）=100 μg·mL-1］1 mL 置50 mL 量瓶中，加2%稀硝酸制成含镍2 μg·mL-1的溶液，作为对照品储备液；取储备液5 mL 置100 mL 量瓶中，加2%稀硝酸溶液制成含镍100 μg·L-1的溶液，作为对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 取样品约0.2 g，精密称定，置消解罐中，加硝酸10 mL，放置过夜，按表2 升温程序进行微波消解，待消解结束后，取出消解罐并加热，挥去大部分酸液（残液约1 mL），将消解罐中的残液转移至25 mL 量瓶中，用超纯水稀释至刻度，得供试品溶液。同法制备空白溶液。

表1 石墨炉升温程序

表2 微波消解条件

1.2.4 线性与范围 镍贮备液的配制以“1.2.2”项下对照品溶液为母液，采用自动配标方式，按“1.2.1”项下的条件以0、10、30、50、80、100 μg·L-1标准溶液进样，以浓度对吸光度绘制标准曲线，得回归方程：Y=5.81×10-3X+2.707×10-2、r=0.999 6，结果表明，利伐沙班中镍元素含量的线性范围：0～100 μg·L-1。

1.2.5 回收率 精密称取每份约0.2 g 利伐沙班（批号为20151001） 共9 份，分别加入含镍量为0.8、1.0、1.2 μg 的硝酸10 mL，每个浓度3 份，按“1.2.3”项下样品处理方法进行前处理，并按“1.2.1”项下的条件进行测定，计算平均回收率为112.0%，RSD 为4.7%。

1.2.6 精密度试验 取“1.2.2”项下对照品储备液1 mL 置50 mL 量瓶中，加2%稀硝酸溶液制成含镍40 μg·L-1的溶液，按“1.2.1”项下的条件，平行测定6次，平均值为40.66 μg·L-1，RSD 为1.6%（n=6）。

1.2.7 检测限与定量限 分别按公式LOD=3.3σ／S、LOQ=10σ／S，确立检测限与定量限。

其中σ 为对空白溶液连续进行11 次测定的响应值的标准偏差，S 为标准曲线的斜率（参照《中国药典》2015 年版四部9101）。计算最低检测浓度为1.9 μg·L-1，分析方法的检测限为0.2 μg·g-1；最低定量浓度为5.9 μg·L-1，分析方法的定量限为0.7 μg·g-1。

1.2.8 样品测定 取利伐沙班6 个批号样品，按“1.2.3”项下方法进行样品前处理，并按“1.2.1”项下的条件进行测定，结果见表3。

表3 样品测定结果汇总表

2 电感耦合等离子体质谱法测定利伐沙班原料药中镍残留

2.1 仪器与药品、试剂

2.1.1 仪器 安东帕微波消解仪（Multiwave3000奥地利安东帕公司）；NexION 300 电感耦合等离子体质谱仪；BP211 电子分析天平（德国赛多利斯公司）。

2.1.2 药品与试剂 利伐沙班由同一厂家提供，批号同“1.1.2”；镍标准溶液（100μg·mL-1，中国计量研究院，批号：16041）；锗标准溶液（10μg·mL-1，PE 公司，批号：CL12-143YPY1）；调谐液（PE 公司）；硝酸；超纯水。

2.2 方法与结果

2.2.1 微波消解程序 消解条件同表2。

2.2.2 ICP-MS 测试条件 发射功率：1.1kW；采样锥：镍锥；雾化器：旋流雾室雾化器；雾化气流速：0.9 L·min-1；等离子体气（氩气）：15.0 L·min-1；辅助气（氩气）：1.2 L·min-1；碰撞气（氩气）：3.0 L·min-1；扫描方式：跳峰；测量点／峰：3 点。扫描质量数：待测元素镍60，内标元素Ge 为74。进样方式：手动进样，内标元素Ge 通过T 型三通管在线引入等离子体。

2.2.3 对照品溶液的制备 取镍标准溶液［C（Ni）=100 μg·mL-1］适量，加2%稀硝酸溶液制成含镍1 μg·mL-1的溶液，作为对照品储备液；取对照品储备液适量，用2%稀硝酸溶液稀释制成0.5、1、5、10、20 ng·mL-1的系列浓度对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液的制备 同“1.2.3”。

2.2.5 内标溶液的制备 精密量取锗标准溶液，用2%稀硝酸溶液稀释制成50 ng·mL-1的内标溶液。

2.3 线性与范围

取“2.2.3”项下系列浓度对照品溶液，按“2.2.2”项下的条件进样测定，以镍元素每秒计数（CPS）与内标锗元素的每秒计数（CPS）的比值为纵坐标，每个对照品溶液对应的浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程：Y=0.289X-7.1×10-2（r=0.999 7）。

结果表明，利伐沙班镍元素含量的线性范围：0.5～20 μg·L-1。

2.4 回收率试验

精密称取利伐沙班（批号20151001）约0.2 g，计9 份，分别加入含镍量为0.125、0.25、0.375 μg 的硝酸溶液10 mL，每个浓度3 份，按“1.2.3”项下方法进行样品前处理，并按“2.2.2”项下的条件测定，计算平均回收率为97.90%、RSD 为1.8%。

2.5 精密度试验

取“2.2.3” 项下10 μg·L-1的镍对照品溶液，按“2.2.2”项下的条件平行测定6 次，平均值为10.10μg·L-1、RSD=0.5%（n=6）。

2.6 检测限设定

仪器自动最低检测浓度为0.056 μg·L-1，分析方法的检测限为0.007 μg·g-1。

2.7 样品测定

取利伐沙班6 批，按“1.2.3”项下方法进行样品前处理，并按“2.2.2”项下的方法进行测定，结果见表3。

3 讨论

本实验建立了石墨炉原子吸收法、电感耦合等离子体质谱法两种方法，分别测定利伐沙班中残留的镍。在方法建立初期研究取样量时，参考了一般药品取样量，结果发现取样0.5 g 时，消解完溶液呈深黄色，略不透明，因此判断需要调整取样量或是消解程序，分别试验了取样0.1、0.2、0.3、0.4 g 以及调整微波消解的功率和保持时间。功率过小则需延长保持时间，功率加大虽然可以缩短保持时间，但消解样品时容易压力过高；减少取样量虽然可以消解完全，但是过少则没有代表性，经试验取样0.1～0.3 g 时，用“2.2.1”的消解程序完全消解且溶液澄清透明。

根据6 批样品的检验结果表明，两种方法对结果的测量无明显差异；但电感耦合等离子体质谱法由于具有分析速度快、检测限更低、灵敏度高以及可多种元素同时测定等优点，在重金属痕量分析检测方面更具优势。