贵州产细毡毛忍冬中绿原酸的含量测定研究

时间：2024-05-22

覃育往，龙滢

(1荔波县妇幼保健院，贵州荔波 558499；2黔东南州食品药品检验检测中心，贵州凯里 556000)

0 引言

细毡毛忍冬(LonicerasimilisHemsl.)为忍冬科植物细毡毛忍冬的干燥花蕾或带初开的花，可以产生清热解毒、截疟的作用[1]。《现代中药材鉴别手册》“金银花”项下附录里的“地区习惯用药”中有提到在部分地区，细毡毛忍冬的花蕾作金银花使用[2]。在《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)里，“银花”项下也收载了细毡毛忍冬，且表示细毡毛忍冬花在贵州省内作为金银花广泛使用，亦为贵州省少数民族用药，是贵州、四川等西南地区金银花药材的主流品种之一[3]。

研究表明，细毡毛忍冬中含有多种生理活性成分，如绿原酸、黄酮类、三萜皂苷类等。绿原酸具有保护心血管、降糖降脂、增强免疫力、抗菌抗病毒等药理作用[4]。绿原酸是细毡毛忍冬产生清热解毒、截疟等作用的主要有效成分之一。目前对贵州产细毡毛忍冬的特征性成分研究还较少，贵州省也没有完整的地方质量标准，因此，本实验通过查阅文献并结合我省资源情况，研究采用HPLC法测定贵州产细毡毛忍冬中绿原酸的含量，希望能为贵州地方标准的制定提供数据参考，同时可以为细毡毛忍冬的开发利用提供一定的参考。

1 仪器与材料

仪器：高效液相色谱仪(Ultimate300及DAD-3000检测器)，色谱柱[Thermo Acucore XL C18(5 μm，4.6×250 mm)]，电子天平(AE-240)，数控型超声波清洗器(KQ-500DA)，隔膜真空泵(GM-0.33A)，摇摆式高速中药粉碎机(DEY-500)。

试药：甲醇(分析纯)、乙腈(色谱纯)、磷酸(优级纯)、蒸馏水、绿原酸(中国食品药品检定研究院，批号110753-201716，含量99.3%，供含量测定用)。

样品：从贵阳市贵安新区、乌当区，毕节市和凯里市采摘，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定，均为细毡毛忍冬。其中贵安新区的分别进行蒸晒(蒸制然后晒干)和晒干(直接晒干)处理，乌当区的进行晒干处理，毕节市和凯里市的进行蒸晒处理，粉碎过四号筛。

2 方法与结果

2.1 色谱条件的选择

流动相：分别比较乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、甲醇-0.4%磷酸溶液等度洗脱的效果，结果乙腈-0.4%磷酸溶液峰形最好，并根据实测考察并调节流动相比例，乙腈-0.4%磷酸溶液(8∶92)峰分离度较好，故采用此作流动相。

检测波长：采用二极管阵列检测器(DAD)对样品进行全波长扫描，结果在327 nm处有最大吸收且分离度和峰形较好，故确定检测波长为327 nm。

柱温：室温。

2.2 供试品溶液的制备

提取溶剂的考察：考虑生产制剂和用药习惯，结合参照物绿原酸具有不稳定性，提取时不能高温、强光及长时间加热，难溶于三氯甲烷、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂，易溶于甲醇、乙醇等亲水性溶剂的理化性质。考察比较了甲醇(50%)、乙醇(50%)作为提取溶剂进行超声处理，结果50%乙醇和50%甲醇提取的色谱信息适中、分离较好但50%甲醇峰形更好，故选择甲醇提取。并对不同浓度甲醇(50%、60%、70%、80%、95%)进行考察，50%～80%的甲醇提取率较高，且峰形和分离度较好，为了节约实验成本，选择50%甲醇作为最终提取溶剂。

提取时间的考察：分别超声10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min进行比较，结果超声时间从10～60 min提取出的绿原酸含量影响不大，考虑到环境差别下可能影响提取率，确保提取完全，故选择适中的30 min为提取时间供试品溶液的制备：取样品粉末0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用50%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液2 mL置10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品适量，用50%甲醇制成39.48168 μg/mL的溶液，作为对照品溶液。

2.4 测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算出供试品中绿原酸的含量(按干燥品计算)。

2.5 方法学考察

2.5.1 系统适应性实验(专属性试验)

对供试品溶液采用二极管阵列检测器(DAD)进行全波长扫描，结果显示绿原酸目标峰匹配度为992，表明该色谱峰是单一组分。

分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品色谱峰与对照品色谱峰保留时间一致。说明本方法专属性良好。实验结果见图1、图2、图3。

图1 样品峰纯度指数匹配Fig.1 Sample peak purity index matching

图2 绿原酸对照品图谱Fig.2 Chromatogram of chlorogenic acid reference

图3 细毡毛忍冬样品图谱Fig.3 Chromatogram of Lonicera similes Hemsl.

2.5.2 线性关系考察

精密地称取绿原酸对照品适量，用50%甲醇分别配制成4.7376 μg/mL、18.9500μg/mL、28.4260 μg/mL、47.3766 μg/mL、66.3272 μg/mL、75.8026μg/mL、94.7532 μg/mL的对照品溶液，测定，记录绿原酸峰面积。以对照品溶液浓度(μg/mL)为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归，求得回归方程为Y=0.5304X-0.194，R2=0.9999，见图4，结果表明绿原酸在4.7376～94.7532 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

图4 绿原酸标准曲线图Fig.4 Standard curve of chlorogenic acid

2.5.3 精密度试验

取同一供试品溶液，连续进样6次，记录绿原酸峰面积，计算峰面积的RSD=0.06%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验

精密称取同一样品粉末6份0.25 g，按供试品制备方法平行处理，测定，记录供试品中绿原酸的峰面积，计算含量，平均含量为3.8120%，RSD=0.24%。表明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验

吸取同一供试品溶液分别在0、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，记录峰面积，计算得RSD=0.79%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批样品粉末(乌当区，含量为3.8120%)0.125 g，共6份，精密加入绿原酸对照品溶液(浓度为0.6016 mg/mL)8 mL，加50%甲醇42 mL，称定重量，按供试品的制备方法从“超声处理30 min”开始依法处理，测定，记录绿原酸峰面积，计算回收率。测定结果见表1。绿原酸的平均回收率为95.16%，表明该测定方法准确度较高。

表1 回收率测定结果Tab.1 Recovery rate results

2.5.7 耐用性

在色谱其他条件不变的情况下，改变柱温箱的温度，分别考察(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)，测得含量的RSD=0.27%，表明柱温的变化对结果基本没有影响，故实验可以根据室温确定柱温。选用色谱柱，Thermo Accucore XL C18(5 μm，4.6×250 mm)、AgilentZORBAX SB-Phenyl(5 μm，4.6×250 mm)、Waters Symmrtry C18(5 μm，4.6×150 mm)、Diamonsil C18(5 μm，4.6×250 mm)，进行测定，测得含量的RSD=0.31%，C18柱和苯基柱比较，苯基柱会改变出峰顺序，且十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子更为常用，故选用C18色谱柱。柱温和不同牌子的色谱柱、不同固定相的改变，都能满足系统适应性，表明实验耐用性较好。