吴茱萸不同产地加工方法HPLC指纹图谱及多成分含量比较*

王先菊，李 玮，杜洪志，张 敏，刘亚琴，邱亚磊

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025)

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode.)Huang或疏毛吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实，其味辛、苦，性热，归肝、脾、胃、肾经。具有助阳止泻、降逆止呕、散寒止痛的功效。在中医临床以及中成药生产中应用广泛，主要治疗厥阴头痛、五更泄泻、呕吐吞酸、腹部胀痛等相关病症[1]。产地加工是中药饮片形成的重要环节，产地加工过程关系到饮片质量的好坏，亦与疗效息息相关，且产地加工是监管的薄弱环节[2-3]，因此产地加工过程的控制就显得尤为重要。经广泛查阅文献，吴茱萸产地加工方法不一，目前主要有晒干、阴干、烘干等方法，由于各地产地加工方法不同，且缺乏具体的工艺参数，导致市面上吴茱萸药材的质量参差不齐。因此本文通过对比对不同产地加工方法吴茱萸的HPLC指纹图以及进行多成分含量测定，为吴茱萸产地加工方法及工艺提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

赛默飞高效液相色谱仪(型号：UltiMate3000，赛默飞)；日本岛津高效液相色谱仪(型号：LC-20AT，日本岛津)；三用紫外仪(型号：ZF-2型，上海市安亭电子仪器厂)；千分之一电子天平(型号：JT5003，余姚市金诺天平仪器公司)；数显恒温水浴锅(型号：HH-2，常州澳华仪器有限公司)；万分之一电子分析天平(型号：ME204E，上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，十万分之一电子分析天平(型号：AUW220D，苏州岛津仪器有限公司)；高速万能粉碎机(型号：LDP-150，浙江永康市红太阳机电有限公司)；真空干燥箱(型号：DZ-2BC，天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 材料

分别收集12批我国不同地区的吴茱萸药材，见表1，经贵州中医药大学药学院生药教研室魏升华教授鉴定为芸香科植物吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth的近成熟果实。去氢吴茱萸碱对照品(批号：67909-49-3)、柠檬苦素对照品(批号：1180-71-8)、吴茱萸碱对照品(批号：518-17-2)、吴茱萸次碱对照品(批号：84-26-4)、吴茱萸新碱对照品(批号：15266-38-3)，均购于贵州迪大生物科技有限责任公司，以上对照品均供含量检测用。

表1 吴茱萸药材样品来源

甲醇(色谱纯，天津科密欧公司)；乙腈(色谱纯，天津科密欧公司)；水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

2.1.1 阴干法

将吴茱萸鲜药材置于阴凉通风处阴干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。

2.1.2 晒干法

将吴茱萸鲜药材置于太阳下晒干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。

2.1.3 烘干法

将吴茱萸药材置于不同干燥箱内40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃烘干，去除残余的枝叶、果柄及杂质。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取吴茱萸样品粉末0.3 g，置50 mL 具塞锥形瓶中，加入70%乙醇30 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷，用70%乙醇补足减失的重量，过滤，取续滤液，以0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素、去氢吴茱萸碱、吴茱萸新碱，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，即得混合对照品溶液，封存，备用。

2.4 色谱条件

Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相0.02%磷酸水(A)-乙腈(B)，柱温25 ℃，流速1 mL·min-1，检测波长215 nm，进样量10 μL，梯度洗脱60 min(0～10 min，95%～74%A；10～20 min，74%A；20～21 min，74%～45%A；21～37 min，45%A；37～45 min，45%～10%A；45～60 min，10%A)。

2.5 含量测定方法学考察

2.5.1 线性关系

精密吸取吴茱萸混合对照品溶液1 μL、4 μL、7 μL、10 μL、13 μL、16 μL、19 μL注入高效液相色谱仪中，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进样量(μg)为横坐标(X)进行线性回归，得去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱回归方程分别为：y=65.598x-1.4687(r=0.9999)、y=9.3915x-0.0159(r=0.9999)、y=134.85x-6.4854(r=0.9997)、y=116.29x-2.4592(r=0.9999)、y=62.485x-2.2224(r=0.9999)，结果表明去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱线性范围分别在0.2 ～ 3.8 μg、1.016 ～19.304 μg、0.26 ～4.94 μg、0.154 ～2.926 μg、0.224～4.256 μg范围内线性关系良好。

2.5.2 精密度试验

精密吸取吴茱萸同一供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件连续进样6次。去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的RSD值分别为2.39%、0.76%、0.83%、0.64%、1.01%，表明实验所用仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件连续进样6次，分别在 0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进行测定，测得去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的RSD值分别为1.40%、1.67%、0.36%、0.59%、1.09%。表明吴茱萸供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.4 重复性试验

精密称取同一批次的吴茱萸药材粉末6份，每份约0.3 g，按“2.2”项下制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定。测得去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的RSD值分别为1.27%、1.21%、0.37%、0.72%、1.22%，表明本实验方法重复性良好。

2.5.5 加样回收试验

精密称取6份已知含量的吴茱萸药材粉末，每份约0.15 g，加入适量对照品制备溶液，按“2.2”项下制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定。结果去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的平均加样回收率分别为100.79%、99.82 %、102.54%、99.66%、99.69%，RSD 值分别为1.79%、2.02%、1.56%、1.13%、1.44%。表明该方法准确可行。

2.6 含量测定结果

按“2.2”项制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定。分别测定不同产地加工方法吴茱萸样品中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱的含量，以此来判断不同产地加工方法对吴茱萸药材中去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、吴茱萸新碱含量的影响。测定结果见表2。

表2 吴茱萸不同加工方法样品含量测定表

2.7 吴茱萸指纹图谱方法学考察

2.7.1 精密度试验

取吴茱萸样品粉末依照2.2项下方法制备供试品溶液，按2.4项下色谱条件进样6次，并记录指纹图谱，通过指纹图谱相似度评价软件，进行峰匹配，所得图谱之间的相似度在0.991～0.999之间，均大于0.900，符合指纹图谱的要求。表明该仪器精密度良好。

2.7.2 稳定性试验

取吴茱萸样品粉末依照2.2项下方法制备供试品溶液，按2.4项下色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样，并记录指纹图谱，通过指纹图谱相似度评价软件，进行峰匹配，所得图谱之间的相似度在0.944～1.000之间，均大于0.900，可见其符合指纹图谱的要求。表明24 h内样品溶液的成分稳定。

2.7.3 重复性试验

取吴茱萸样品粉末6份，依照2.2项下方法制备供试品平行溶液，按2.4项下色谱条件分别进样，并记录指纹图谱。通过指纹图谱相似度评价软件，进行峰匹配，所得图谱之间相似度在0.995～1.000之间，均大于0.900，可见其符合指纹图谱的要求。表明此方法重复性良好。

2.8 指纹图谱的建立及共有峰的标定

使用“1.2”项下12批吴茱萸药材为材料，按“2.2项”下的方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样，记录HPLC指纹图谱，见图1；取2.3项下的对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图3。然后将12批药材的指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统》2012版(国家药典委员会)，进行色谱峰匹配，并生成对照指纹图谱，见图2。

图1 12批吴茱萸药材HPLC指纹图谱共有模式

通过对12批吴茱萸药材指纹图谱进行比较，标定了10个指纹图谱中的共有峰见图2，与混合对照品的指纹图谱图3进行比对定性，确认了3号峰为去氢吴茱萸碱、5号峰为柠檬苦素、6号峰为吴茱萸碱、7号峰为吴茱萸次碱、10号峰为吴茱萸新碱。并选择6号峰吴茱萸碱作为参照峰，其在吴茱萸药材指纹图谱中保留时间适宜，峰形较稳定，另外吴茱萸碱也是吴茱萸药材的主要成分之一，对照品易于购买，因此选定吴茱萸碱为参照峰。

图2 对照指纹图谱

图3 混合对照品图

2.8.1 吴茱萸药材相似度的计算

以“2.8”项下建立的共有模式为参照图谱计算1～12批样品的相似度。从相似度数据表1和图1中可以看出不同地区的吴茱萸药材相似度在0.294～0.995之间，差异较大，说明不同产地的吴茱萸所含化学成分差异较大。

表3 12批吴茱萸药材指纹图谱相似度分析结果

2.8.2 吴茱萸不同产地加工方法样品指纹图谱与共有模式的比较

将吴茱萸不同产地加工方法样品测定的HPLC指纹图谱导入指纹图谱相似度评价系统软件，进行色谱峰自动匹配，并与建立的共有模式进行对比，结果见表4。

表4 不同加工方法吴茱萸样品HPLC指纹图谱相似度分析结果

结果表明，不同加工方法的吴茱萸样品指纹图谱相似度均在0.900以上，相似度良好，说明不同加工方法的吴茱萸样品整体化学成分具有高度的一致性。

3 结果与讨论

本实验建立了12批吴茱萸药材HPLC指纹图谱的共有模式，以共有模式为参照图谱计算1～12批吴茱萸药材的相似度，结果表明，1～12批样品的相似度差异较大，说明不同产地的吴茱萸药材相似度差异较大，即产地对吴茱萸的化学成分影响较大。吴茱萸不同产地加工方法药材相似度均在0.900以上，表明不同产地加工方法的吴茱萸药材整体化学成分类型相对稳定。然而经过不同产地加工方法加工后主要成分含量发生明显变化，温度逐渐升高时，各成分的含量均有明显下降的趋势。实验表明，在50 ℃烘干时，吴茱萸各成分综合含量最高，为吴茱萸的产地加工方法提供了依据。综上，不同产地加工方法吴茱萸药材，整体化学成分具有高度的一致性，但各成分内在含量有差异，在进行产地加工时，吴茱萸中含有挥发油类成分，因此不建议采用高温进行加工。应注意控制温度，以50 ℃烘干为宜。