生活垃圾填埋场微生物群落结构与功能*

刘洪杰，徐晶，赵由才，宋立岩

（1.中国科学院重庆绿色智能技术研究院环境微生物与生态研究中心，重庆400714；2.中国科学院大学，北京100049；3.同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室，上海200094）

生活垃圾填埋场微生物群落结构与功能*

刘洪杰1，2，徐晶1，2，赵由才3，宋立岩1

（1.中国科学院重庆绿色智能技术研究院环境微生物与生态研究中心，重庆400714；2.中国科学院大学，北京100049；3.同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室，上海200094）

生活垃圾进入到卫生填埋场后，在微生物菌群的作用下经历了好氧、厌氧酸化、初期产甲烷以及稳定产甲烷阶段逐步达到稳定，同时其有机质最终生物转化为甲烷。对基于传统微生物技术与新发展的宏基因组等生物技术研究填埋场各阶段微生物菌群结构与功能的结果进行综述，发现生活垃圾组成异质化及垃圾所处环境不同造成了填埋场微生物群落因地各异。并提出了此环境群落变化的主要研究难点和研究方向。

填埋场；微生物群落结构与功能；甲烷氧化菌

垃圾被填埋后，垃圾中的可降解组分经过一系列复杂的生物化学反应最终得以分解。各种不同微生物通过对物质的竞争及相互间的协同作用共同完成对垃圾的降解过程［1］。垃圾降解一般经历4个阶段：好氧阶段、厌氧酸化阶段、初始产甲烷阶段和稳定产甲烷阶段［2］。由于各阶段环境条件与基质具有差异，因此各阶段微生物种群各不相同［1］。尽管垃圾的组分有很大的差异，但是生活垃圾中均含有较多的有机质，例如纤维素和半纤维素等［3］。这些有机质在经历上述的降解过程后最终转化为甲烷。而实现纤维素等有机质降解至甲烷这一过程的主要菌群包括：纤维素水解菌群、产氢产乙酸菌群和产甲烷菌群等［1，4-5］。填埋场运行过程产生大量的甲烷及其他气体混合物（二氧化碳、硫化氢、卤代烃和芳香族等）在逸散过程中会驯化填埋场覆土，引起覆土微生物群落结构与填埋体明显不同，其中重要的差异即覆土微生物菌群含有大量的甲烷氧化菌［6］。

相比污水处理厂、污染土壤等环境介质，垃圾填埋场作为一个特殊的环境单元，其微生物演替过程研究较少。Peter Kjeldsen等综述了填埋场垃圾降解过程渗沥液理化指标变化［2］；杨琦等综述了影响填埋场内垃圾降解的因素，分析了其中的微生物种类和数量及其相互关系［7］；Balaz等通过传统的选择性培养基对垃圾降解过程中的微生物变化进行了较为详细研究［1］；Jeremy等在菌株和16S rRNA克隆文库水平研究基础上对填埋场垃圾降解过程微生物群落的演化规律进行综述［8］。近10 a生物技术的迅速发展，尤其是宏基因组等技术广泛运用到环境介质微生物群落的研究中，让我们意识到自然界微生物数量及种类的巨大多样性，而可培养的微生物大约只有1%。因此本研究对过去20 a基于传统微生物技术与新发展的宏基因组等分子生物学技术研究填埋场微生物群落结构与功能的结果进行综述，为填埋场的运行管理以及设计新一代卫生填埋场提供微生物学的理论支持。

1 填埋场微生物群落的主要演替规律

填埋场内各种物质的转化并非特异的存在于某一个特定的时期，而是贯穿于整个稳定化过程之中，但是每个特定阶段占主导的微生物种类不同或者某一微生物的作用凸显，引起宏观上的特征参数发生变化，因此可以人为的将填埋场稳定化过程划分为4个阶段：好氧阶段、厌氧酸化阶段、初始产甲烷阶段和稳定产甲烷阶段［1-2］。

1.1 好氧阶段（Aerobic phase）

填埋场覆土封场后，垃圾降解进入到初始好氧阶段。填埋初期，残留在新鲜垃圾缝隙空间的氧气迅速地被消耗，使简单有机物发生好氧生物降解生成二氧化碳和水并产生大量的热［2］。垃圾的好氧生物降解过程是垃圾中可溶性有机物透过微生物细胞壁与细胞膜被微生物直接吸收，不溶性有机物被吸附在微生物体外，在微生物分泌的胞外酶的作用下水解成小分子可溶性物质，再渗入细胞，然后在微生物的合成代谢与分解代谢作用下被消耗掉的过程［9］。此阶段填埋场内部温度迅速升高但仅维持数天，产生的填埋气主要为微生物好氧分解代谢所产生的二氧化碳［1］。由于此阶段反应非常迅速，无论是可培养或者不可培养技术均对此阶段的微生物群落结构鲜有研究。

1.2 厌氧酸化阶段（Anaerobic acid phase）

伴随氧气快速耗尽，填埋场迅速成为一个厌氧环境。在厌氧条件下，高分子有机物如纤维素和半纤维素被胞外酶缓慢水解成小分子可溶性有机物，与上阶段未消耗的糖类一同厌氧发酵产生短链脂肪酸、乙醇和二氧化碳，最后被产氢产乙酸菌利用生成乙酸和氢气，导致羧酸积累。在此阶段，水解、发酵和产乙酸细菌占主要优势［2］。在水解和酸化电子传递的过程中微生物都会消耗一定的NH4+和碱度，较强的水解酸化作用使得该阶段pH下降［10］。这一阶段的菌群主要包括：纤维素水解菌群、产酸菌群和产氢产乙酸菌群。

由454测序技术分析处于该时期的一个渗沥液样品可知：厚壁菌门（Firmicutes）是最主要的细菌门类，与变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和螺旋体门（Spirochaetes）一共占总细菌序列的90%左右［11］。填埋场中厚壁菌门与拟杆菌门细菌主要功能是水解纤维素和淀粉等多糖，变形菌门可以分解可溶性糖类为单糖和短链脂肪酸［12］。

1.2.1 纤维素水解菌群

自然界中可以降解纤维素的物种绝大多数分布在细菌域和真核生物域的真菌界中。好氧纤维素水解细菌多为放线菌门（Actinobacteria）的放线菌目（Actinomycetales），而厌氧多为厚壁菌门中的梭菌目（Clostridiales）［13］。纤维素水解细菌主要包含：厌氧发酵细菌、好氧革兰氏阳性细菌和好氧滑动细菌。厌氧发酵型纤维素水解细菌通常是梭菌属（Clostridium）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）和热解纤维素果汁杆菌属（Caldicellulosiruptor）的革兰氏阳性菌，但也包含一些丁酸弧菌属（Butyriv ibrio）、醋酸弧菌属（Acetivibrio）和纤维杆菌属（Fibrobacter）等革兰氏阴性菌；好氧革兰氏阳性纤维素水解细菌有纤维单胞菌属（Cellulomonas）和高温双歧菌属（Thermobifida）［14］；好氧纤维素水解滑动细菌有噬纤维菌属（Cytophaga）和生孢噬纤维菌属（Sporocytophaga）［13］。

垃圾中纤维素物质占40%～70%［15］，代表填埋场最丰富的可生物降解有机质，因此研究填埋场水解菌群的主要对象为纤维素水解种群。在填埋场群落的研究过程中，已发现的可水解纤维素的微生物除了早期Hungate通过分离培养获得的丁酸弧菌和瘤胃球菌属外还有：梭菌属［16-18］、醋酸弧菌属［16］、纤维杆菌属［19-20］、微杆菌属（Microbacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）［20］、优杆菌属（Eubacterium）［18］、溶杆菌属（Lysobacter）［21］、纤维单胞菌属、链霉菌属（Streptomyces）等细菌以及真菌中的毛霉属（Mucor）［22］和新美鞭菌目（Neocallimastigales）［23］。研究发现纤维素的厌氧降解过程则可能主要由梭菌属（厚壁菌门）和/或纤维杆菌属（纤维杆菌门）控制［12，15，19］。

可能受填埋场初期大量羧酸和好氧阶段后仍剩余的小分子糖类等的抑制作用，模拟实验中厌氧纤维素水解菌群后期才表现出较快的生长迹象［1］。实地填埋场好氧纤维素水解菌的研究发现在不同填埋区域，好氧纤维素水解细菌个数差别较大难以进行比较［20］。纤维素水解过程较慢，可能在稳定产甲烷期间决定着产甲烷的速率［1］。

1.2.2 产酸细菌

厌氧发酵过程可以将糖类转变为短链脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸）、乙醇、二氧化碳和氢气。在填埋场中大多数发现的异养微生物都需要厌氧呼吸进行生长从而完成这一过程。填埋场中可能与产酸相关的细菌有厚壁菌门中的梭菌属、Sedimentibacter、Anaerobranca、Atopostipes及优杆菌属、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）和拟杆菌门中的Proteiniphilum、普氏菌属（Prevotella）及Petrimonas还有梭杆菌门（Fusobacteria）［11-12，21］。

1.2.3 产氢产乙酸细菌

产氢产乙酸细菌是一类严格厌氧的真细菌，可以转化发酵产物中的短链脂肪酸（除乙酸）和醇类为乙酸、氢气和二氧化碳等，但这一过程大多需要和产甲烷细菌等共同完成［24］。填埋场中有机酸尤其是乙酸的产生过程仍是一个黑箱模型［8］，而且由于产氢产乙酸细菌大多为专性互营细菌，很难在填埋场微生物群落的探索过程中对其进行独立的培养和研究。在填埋场的研究中检测到的能够产氢产乙酸细菌的属有Atopostipes、互营单胞菌属（Syntrophomonas）、Proteiniphilum、Petrimonas、Pelotomaculum、Gelria［11-12］。

1.3 初始产甲烷阶段（Initial methanogenic phase）

不同填埋场的优势产甲烷菌如表1所示。垃圾降解进入初始产甲烷阶段时可明显检测到甲烷的产生。微生物利用乙酸为电子供体会产生一定的碱度，从而引起环境pH升高［10］。解除了过酸环境抑制作用的产甲烷古细菌随后开始利用酸化阶段积累的羧酸并生成甲烷和二氧化碳，其中氢气/二氧化碳和乙酸是主要基质。纤维素和半纤维素的水解也随着环境pH上升而逐步消除抑制开始进行［2］。由于产甲烷过程最后一步转化主要由产甲烷菌完成，因此该阶段微生物菌群研究主要集中在产甲烷古细菌，而对于真细菌研究较少。

表1 不同填埋场的优势产甲烷菌

宋立岩等用454高通量测序技术对处于此阶段的填埋场渗沥液样品进行了研究，结果表明在初始产甲烷阶段的一个时间点上细菌群落构成为：变形菌门占总细菌的59.6%，厚壁菌门占21.3%，拟杆菌门占11.5%，而其他门类包括酸杆菌门、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、浮霉菌门（Planctomycetes）等组成了剩下的7.6%。在属分类上则是假单胞菌属（Pseudomonas）占53.5%，未分类Ruminococcaceae占8.3%，Petrimonas占6.2%，Sulfurimonas占4.6%［25］。

产甲烷菌隶属于古菌域中的广古菌门（Euryarchaeota），是严格厌氧的原核生物，根据营养类型分为氢营养型、乙酸营养型和甲基营养型3类。以系统发育为主的产甲烷菌最新分类将产甲烷菌分为5个大目：甲烷杆菌目（Methanobacteriales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷火菌目（Methanopyrales）和甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales）［26］。目前能够利用乙酸产甲烷的只有甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）和甲烷鬃菌属（Methanosaeta）2个属［27］。填埋场垃圾降解过程中产甲烷菌有一定的多样性，优势菌主要为甲烷杆菌目、甲烷微菌目和甲烷八叠球菌目［28-30］。甲烷杆菌目和甲烷微菌目所包含的菌属主要是氢营养型，甲烷八叠球菌目的菌属有氢营养型、乙酸营养型以及甲基营养型。氢营养型的甲烷微菌目和甲烷八叠球菌目已经在模拟填埋场反应器中以优势产甲烷菌被发现［16，31］。而以渗沥液为研究对象的实验则有些发现优势类群为乙酸型的甲烷八叠球菌属和甲烷鬃菌属以及氢营养型的甲烷杆菌目［28，32］，还有些研究发现优势类群为甲烷微菌目［29］。

填埋场长时间的定向选择可能会使得老龄垃圾中产甲烷菌多样性低于低龄垃圾［33］。根据反应器模拟，垃圾的产甲烷过程可分为3个阶段：第1阶段由氢营养型主导，第2阶段乙酸营养型显著升高，成为主要营养类型，第3阶段乙酸营养型逐渐降低，最终氢营养型再次占优势［34］。但这种规律在实地填埋场中并未得到验证。各填埋场所具有的产甲烷菌生长规律可能随着各地垃圾组分和操作环境不同而有所变化（见表1）。

1.4 稳定产甲烷阶段（Stable methanogenic phase）

垃圾中的羧酸逐步被耗尽后，尽管发酵细菌产酸速率较快，但纤维素和半纤维素水解过程进行得比较缓慢，因此产甲烷速率不再加快，垃圾进入稳定产甲烷阶段。在此阶段由纤维素和半纤维素水解速率决定了产甲烷速率。羧酸产生与消耗达到一个动态平衡，pH上升至一个稳态范围［2］。

由454高通量测序分析表明在稳定产甲烷阶段一个时间点上细菌群落主要构成为：拟杆菌门占总细菌的49.4%，变形菌门占39.9%，厚壁菌门占4.3%，而其他门类包括硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、浮霉菌门、绿菌门（Chlorobi）和绿弯菌门（Chloroflexi）等组成了剩下的7.6%。精确到属后优势菌分别是Fluviicola、Balneola、极小单胞菌属（Pusillimonas）各占13.4%、13.1%和7.1%，而假单胞菌属则只占2.7%。古细菌群落组成为：甲烷微菌目占57.6%，盐杆菌目（Halobacterials）占20.3%，热原体目（Thermoplasmatales）占2.8%，甲烷八叠球菌目占3.3%，甲烷杆菌目占1.2%［25］。

填埋过程有机物最终转化为的甲烷是一种温室气体，会加剧全球变暖的过程。甲烷在逸散的过程会与垃圾和覆土接触，能驯化出可以氧化甲烷的物种。上覆土为甲烷氧化的主要场所［6］。甲烷氧化菌以甲烷为唯一碳源和能源，可以分泌甲烷单氧酶氧化甲烷为甲醇。而后甲醇在甲醇脱氢酶的作用下氧化为甲醛，继而在甲醛脱氢酶的催化下氧化为甲酸，最后经甲酸脱氢酶氧化成二氧化碳。大部分甲烷氧化菌在分类学中属于γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）和α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）［37］。从填埋场覆土中发现的可以氧化甲烷的物种有甲基暖菌属（Methylocaldum）、嗜甲基营养菌属（Methyloversatilis）［38］、甲基杆菌属（Methylobacter）、甲基囊孢菌属（Methylocystis）［39］、甲基热菌属（Methylothermus）、甲基微菌属（Methylomicrobium）、甲基弯曲菌属（Methylosinus）［40］和甲基八叠球菌属（Methylosarcina）［41］。而邢志林等对覆土甲烷氧化进行模拟研究发现：随覆盖层梯度增加甲基杆菌属细菌比例呈现减小趋势而甲基球菌目呈现增加趋势［39］。填埋场覆土中甲烷氧化过程的优势菌种多为I型甲烷氧化菌中的甲基杆菌属和II型甲烷氧化菌的甲基囊孢菌属［39-41］。由于I型甲烷氧化菌对比于II型甲烷氧化菌有更高的甲烷亲和性，那么可以猜测在填埋场覆土靠近地表部分甲烷浓度低而有利于I型甲烷氧化菌，而靠近垃圾层及其垃圾层内部由于高浓度甲烷而更有利于II型甲烷氧化菌生长，不过并未有实验来验证这一结论。

2 讨论与展望

生活垃圾组成异质化及垃圾所处环境不同造成了填埋场微生物群落因地各异［20，29］。因此对这一生境微生物群落结构与功能研究非常困难。目前对此环境群落变化研究的主要难点在于：采样代表性问题和群落结构长期监测的可行性问题。

填埋场内部物质分布不均匀可能造成了同一填埋场内不同区域的微生物群落结构不同［29］，甚至不同区域可能处在不同的垃圾降解时期。以渗沥液中的微生物作为填埋垃圾微生物的代表有一定的合理性，但是一些黏附于垃圾表面形成生物膜的种类可能不易于随渗沥液排出，且微生物下渗后在收集单元内与营养物质充分接触，势必也会发生一些变化，因而不能单独用来精确地描述填埋场内部复杂的生理状况［42］。

以往对填埋场内微生物结构的研究往往只在一个时间点上进行，没有连续的监测微生物群落结构变化也导致对该生境微生物结构与功能的了解不足。填埋场一经覆土很难对其内部进行长期检测，如果在搭建初期就将这一问题作为考虑范围，对该生境研究、管理和考核都有重要的意义。

尽管宏基因组等分子生物学技术发展迅速，但是其应用到垃圾降解过程甚少。有限的应用宏基因组技术的研究一定程度上揭示了垃圾降解过程巨大的微生物群落结构与功能。但垃圾填埋场的管理（甲烷产生、回收等）以及下一代快速稳定垃圾填埋场的设计仍需要更全面的微生物学支持。有关填埋场内部微生物种群和群落的生态以及不同微生物类群之间的相互作用仍有待更深入的研究。

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Microbial Community Structure and Function in Municipal Solid Waste Landfill

Liu Hongjie1，2，Xu Jing1，2，Zhao Youcai3，Song Liyan1
（1.Environmental Microbiology and Ecology Research Center，Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology，Chinese Academy of Sciences，Chongqing400714；2.University of Chinese Academy of Scienses，Beijing100049；3. State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse，Tongji University，Shanghai200094）

After buried，municipal solid waste（MSW）undergoes a series of reaction phases（aerobic phase，anaerobic acid phase，initial methanogenic phase，and stable methanogenic phase）and consequently reaches to stable phase.At the same time，the organic matter is converted into methane by microbial community.Traditional microbiology technique and the emerging metagenomics techniques have been used to investigate the variation of microbial community structure and function during refuse decomposition in landfill.We reviewed the related studiesand found that the heterogeneity of refuse and local environment are the main factorsin shaping microbial community structure and function.Based on these findings，the obstacle and further study were discussed.

landfill；microbial community structure and function；methanotroph

X705；Q938

A

1005-8206（2017）02-0005-06

刘洪杰（1991—），硕士研究生，主要研究方向为固体废物处置与资源化。

E-mail：liuhongjie@cigit.ac.cn。

宋立岩，副研究员。

E-mail：songliyan@cigit.ac.cn。

国家自然科学基金(51578528)

2016-11-06