芦苇厌氧联产氢气-甲烷过程中古菌群落特征解析*

贾 璇 任连海 席北斗 祝超伟 李鸣晓# 赵由才

(1.北京工商大学食品学院环境科学与工程系，北京 100048；2.中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012；3.同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室，上海 200092)

水体富营养化导致水生植物大量繁殖，芦苇是我国湿地、草型湖泊生态系统的重要组成部分，在污水净化和吸附重金属方面尤为突出[1]。但芦苇生长末期除部分用作饲料、燃料外，大部分残体在水中腐解，对水生态系统造成严重危害[2]。芦苇纤维素、半纤维素等有机质含量高[3]，是生物质能源化利用的理想原料，氢气-甲烷联产工艺依据相分离原理，将厌氧发酵过程分为产氢阶段和产甲烷阶段，获得氢气和甲烷两种能源，能源转化效率最高可达89%，是实现芦苇减排产能的重要途径[4-6]。笔者长期从事有机废物厌氧联产工艺研究[7-8]，由于厌氧联产过程复杂，多种微生物相互作用机制不清，微环境难控，使工艺稳定运行困难。产甲烷菌是一类极端厌氧古菌，位于厌氧消化食物链的最末端，是厌氧生物处理工艺中最重要的限速步骤，其群落的组成和数量的变化直接影响厌氧发酵速率和产气量[9-10]。

以聚合酶链式反应(PCR)扩增为主的非培养技术的发展揭示了环境中庞大的微生物多样性[11]。PCR—变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术不仅可以研究古菌群落在时间和空间上的动态变化，还可以通过序列分析或探针杂交确定其中的种群组成[12-13]，对阐明厌氧联产过程的微生物作用机制具有重要意义。KEYSER等[14]应用DGGE技术测定了3种厌氧反应器污泥颗粒中的产甲烷古菌的指纹图谱，同时对产甲烷古菌进行了鉴定。王庆等[15]采用PCR—DGGE技术分析了农村沼气池产甲烷古菌的多样性，其中以甲烷囊菌属(Methanoculleus)和小甲烷粒菌属(Methanocorpusculumparvum)为主。目前，已有的研究多集中在研究传统单相厌氧发酵工艺中微生物群落变化[16-18]，但采用厌氧联产氢气-甲烷工艺，针对水生植物秸秆开展古菌群落特征及演替规律的研究还鲜有报道。

本研究以典型水生植物芦苇为研究对象，采用PCR—DGGE技术分析氢气-甲烷联产不同阶段古菌群落的组成和结构，探讨联产过程中古菌群落的演替规律，以期为厌氧发酵联产的微生物作用机制和生物强化研究提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验设计

芦苇采集自内蒙古自治区乌梁素海，芦苇干样含碳量33.77%(质量分数)，含氮量0.57%(质量分数)，总固体(TS)98.68%(质量分数)，挥发性固体(VS)91.39%(质量分数)，灰分7.28%(质量分数)。接种的厌氧消化污泥含碳量35.20%，含氮量3.06%，TS 16.69%，VS 11.97%，灰分4.72%。取32 g芦苇干样，加入10 mg/g纤维素酶R-10浸泡，固液比为1∶12(质量比)，48 ℃进行酶解预处理，预处理时间48 h。预处理后的芦苇样品接种200 mL厌氧消化污泥，污泥添加量为发酵总体积的12.5% (体积分数)，培养体积1.6 L，通入高纯氮气5 min以排除反应瓶中的空气，37 ℃中温发酵，搅拌速度150 r/min。采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节初始pH为5，产氢阶段发酵周期为4 d，分别于0、6、12、24、36、60、96 h采集样品，编号为H1～H7；待产氢过程结束，调节pH至7，产甲烷阶段发酵周期为18 d，分别于42、66、90、114、162、210、258、306、432 h采集样品，编号为M1～M9。

1.2 总DNA提取

采用BIOTEKE淤泥基因组DNA快速提取试剂盒提取基因组DNA，置于-20 ℃保存备用。

1.3 古菌目的片段扩增

PCR体系：10×Buffer 5 μL、dNTP 4 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、模板DNA 20～50 ng、Tag聚合酶(Takara，大连)1.5 U、灭菌高纯水补齐至50 μL。

扩增条件：采用Touch Down PCR，以增加产物的特异性。反应条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，68～58 ℃退火30 s(退火温度从68 ℃降到58 ℃，每个循环降低1 ℃，经10个循环后，退火温度降至58 ℃)，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，20个循环，最后72 ℃延伸10 min。用于PCR扩增的引物如表1所示。

1.4 PCR—DGGE分析

1.4.1 PCR产物DGGE

PCR产物用1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测片段大小和浓度。取20 μL PCR产物(约200 ng)与10 μL 5×Loading buffer混匀后进行电泳，以去离子甲酰胺和尿素为变性剂，其中古菌变性梯度为40%～70%，聚丙烯酰胺胶质量分数为8%，电压20 V预电泳10 min，电压130 V电泳6 h，温度恒定为60 ℃。电泳结束后，凝胶以Gel-Red染色剂染色30 min，洗涤后于Bio-Rad USA上扫描成像分析。

1.4.2 条带回收及纯化

在345 nm波长下将优势差异条带和共性条带切下，洗净后浸泡于装有高纯水的2 mL无菌离心管中，捣碎后加入60 μL TE缓冲溶液，4 ℃放置24 h。取5 μL回收产物作为模板，选用无GC夹的上述PCR扩增的引物，按1.3节再次扩增。选用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit进行PCR产物回收纯化。

表1 用于古菌PCR扩增的引物

图1 芦苇厌氧联产不同阶段累积产气量和生物气产量变化情况Fig.1 The maximum cumulative biogas production and proportion from reed under different stages

1.4.3 克隆测序

DNA溶液全量10 μL，加入100 μL JM109感受态细胞中，再加入890 μL SOC培养基，37 ℃振荡培养60 min。于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB平板培养基上培养。取单菌落培养后进行质粒提取，采用3730xl测序仪测序，测序结果提交GenBank并获得接受号。利用BLAST程序对测序结果进行同源性分析，获得相关种属的序列信息。

1.5 DGGE图谱相似性分析

结合ImageJ、Mathworks Matlab v7.1以及PAST软件对DGGE图谱进行分析。首先用ImageJ软件对DGGE图谱数字化，再以Mathworks Matlab v7.1软件对数字化DGGE图谱进行补点处理，最后用PAST软件选取欧几里德距离作为参数进行聚类分析。

1.6 分析方法

累积产气量采用排水法测定。氢气和甲烷产量采用SP-6890型气相色谱仪测定。色谱条件：氢火焰离子化检测器，色谱柱为3 mm内径不锈钢填充柱(TDx-01高分子小球)，柱室、汽化室和检测室的温度分别为120、150、150 ℃，氩气为载气，纯度≥99.999%，流速为40 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 芦苇厌氧联产氢气和甲烷情况

芦苇秸秆经纤维素酶R-10处理后进行厌氧联产，结果如图1所示。产氢阶段初期酶处理组产气量迅速上升，12 h后产气量缓慢上升，产氢阶段最大累积产气量为1 360 mL，是未经预处理对照组的3倍。酶处理组氢气体积分数12 h达到最高，为52.1%，随着反应进行氢气体积分数逐渐降低。产甲烷阶段，酶处理组累积产气量随时间稳定上升，353 h累积产气量最高达4 400 mL，是对照组的5倍，甲烷体积分数随时间显著上升。对照组最大甲烷体积分数为68.4%。可见，芦苇经纤维素酶R-10预处理后氢气和甲烷产量显著提高。KAPOOR等[19]指出，纤维素酶可特异性地吸附在秸秆的纤维素结构上，促进植物细胞壁溶解，使细胞内物质溶解出来，并将大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质，提高了底物利用效率和产气潜力。

2.2 古菌DGGE图谱分析

从图2可以看出，厌氧联产不同阶段的古菌DGGE条带种类和分布表现出了明显的差异，产甲烷阶段的古菌种类和数目明显高于产氢阶段，尤其是产甲烷阶段初期表现出了较高的微生物多样性。条带7、10、13为两个阶段的共有条带，贯穿整个厌氧发酵联产过程，但在两个阶段发酵过程中各条带亮度和持续时间不同。条带7在产甲烷阶段的中后期尤其是泳道M6、M7、M8中亮度高、宽度大和持续时间长，但在产氢阶段亮度低、宽度窄、持续时间很短。条带10则在产氢阶段和产甲烷初期较为明显，到产甲烷高峰期逐渐减弱，两个阶段特有的生态条件为不同微生物的生长创造了适宜的条件，造成了两个阶段优势古菌的差异性。

图2 古菌DGGE图谱Fig.2 Archaea DGGE band patterns

条带2、5分别在产氢阶段后期和产氢阶段初期出现，为产氢阶段的特有条带，产氢阶段末期泳道H7至产甲烷阶段，该条带消失。条带3、8、12、14、15是产甲烷阶段的特有条带，出现在产氢阶段末期和产甲烷阶段，为产甲烷阶段优势菌群。产甲烷阶段，发酵环境pH为中性，适宜产甲烷菌生长，使底物中的古菌数量显著提高。而条带4仅出现在产氢阶段末期和产甲烷阶段初期，即泳道H7和M1～M3。可见，随着芦苇厌氧联产的进行，古菌群落组成发生了显著的演替变化，表现在DGGE图谱上条带数目和亮度的规律性变化。

2.3 古菌群落相似性分析

利用 BIO-RAD QUANTITY ONE 4.6.2软件处理所得到图谱，用戴斯系数(Cs)计算微生物群落的相似性：

Cs = 2j/(a+b)

(1)

式中：j为样品 A 和 B 共有的条带数；a和b分别为样品 A 和 B 中各自的条带数。

Cs取值范围为0(没有相同条带)～1(所有的条带相同)。依据 Complete Linkage算法对DGGE条带进行聚类分析。

氢气-甲烷联产不同阶段代谢产物的相似性(见表2)和聚类分析(见图3)表明，相邻时间的图谱相似性较高，聚为一类，不同阶段代谢产物的图谱相似性较低。在产氢阶段初期，种群结构的Cs最高达94.2(泳道H1、H4)。随后产氢阶段的种群结构Cs均较高，分别为86.8(泳道H1、H2)、79.0(泳道H1、H3)、71.0(泳道H1、H7)。可见，产氢阶段古菌的微生物群落结构比较稳定，古菌种类基本保持不变。

表2 基于Cs的相似性矩阵

表3 古菌条带序列的比对结果

图3 古菌DGGE图谱的聚类分析图Fig.3 Clustering analysis for DGGE profile of archaea

产甲烷阶段中期，也是产甲烷高峰期，种群结构相似性的Cs分别为77.9(泳道M6、M7)、90.9(泳道M6、M8)，产甲烷末期，Cs显著下降为58.0(泳道M6、M9)，随着产甲烷的进行，古菌群落结构发生了显著更替，产氢阶段初期和产甲烷阶段末期的Cs仅为43.4(H1、M9)。可见，厌氧联产过程中古菌的微生物群落组成和功能发生了规律性的更替，其中产氢阶段古菌群落结构相似性较高，产甲烷阶段古菌群落的微生物多样性显著提高。

2.4 古菌群落序列分析

将厌氧联产不同阶段的古菌条带进行切胶测序，测序结果提交到GenBank进行比对，结果如表3所示。测得的序列条带与基因库中已知微生物的同源性比例均在99%以上，经BLAST后的古菌序列主要为Methanoculleus、产甲烷古菌(Methanogenicarchaeon)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)和传统方法不可培养的unculturedMethanosarcinalesarchaeon。其中，Methanogenicarchaeon、Methanoculleushoronobensis等产甲烷菌在厌氧发酵过程中始终存在，主要通过氢营养途径合成甲烷。产氢阶段的优势古菌为unculturedMethanosarcinalesarchaeon(条带10)，属于不可培养微生物，能够利用乙酸途径产甲烷，它们通过裂解乙酸，还原甲基碳产生甲烷，同时氧化其羧基碳产生二氧化碳[20]。产氢高峰期，Methanoculleusmarisnigri(条带2)出现。产氢阶段末期到产甲烷阶段的过渡期，出现Anaerobicmethanogenicarchaeon(条带9)，在功能上起着承上启下的作用。产甲烷高峰期，古菌群落丰富，其中Methanoculleusbourgensis(条带3)是产甲烷阶段的优势微生物[21]。 SONG等[22]也从秸秆和畜禽粪便混合厌氧消化系统中发现了Methanosarcina、Methanosaeta、Methanoculleus等6类产甲烷菌。

3 结 论

采用PCR—DGGE技术，研究了芦苇厌氧发酵联产氢气-甲烷过程中古菌群落组成和演替规律。随着芦苇厌氧联产的进行， DGGE图谱上条带数目和亮度的规律性变化，群落相似性和聚类分析表明，相邻时间的图谱相似性较高，聚为一类，不同阶段代谢产物的图谱相似性较低，厌氧联产过程中古菌的微生物群落组成和功能发生了规律性的更替，其中产氢阶段古菌群落结构相似性较高，产甲烷阶段古菌群落的微生物多样性显著提高。

序列分析表明，厌氧联产氢气-甲烷过程中存在古菌主要有Methanoculleus、Methanogenicarchaeon、Methanobacterium和unculturedMethanosarcinalesarchaeon等。产氢阶段的优势古菌为unculturedMethanosarcinalesarchaeon，能够利用乙酸途径产甲烷。产氢高峰期，出现Methanoculleusmarisnigri。产氢阶段末期到产甲烷的过渡期，出现Anaerobicmethanogenicarchaeon，在功能上起着承上启下的作用。产甲烷高峰期，古菌群落丰富，Methanoculleusbourgensis是产甲烷阶段优势菌。

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