QuEChERS/GC-MS/MS测定人参中41种农药残留

姚蕴恒，白龙律，武伦鹏，吴信子，何 苗，李东浩，任秀丽

(1.延边朝鲜族自治州检验检测中心，吉林 延吉 133000；2.延边大学 长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室,吉林 延吉 133002；3.延边大学 工学院,吉林 延吉 133002)

人参，多年生草本植物，又称“百草之王”，东北三宝之一，其药用价值极高，具有抗肿瘤、抗高血压、抗衰老、降血脂[1]等功效，作为一种膳食补充剂已被人类食用上千年。为了使人参在种植和储存过程中免受病、虫害侵袭，农药的使用必不可少[2]，因不规范使用造成人参中农药残留超标时有发生，严重威胁消费者身体健康[3]。我国已有标准[4-5]规定了人参中农药残留最大限量(MRL)，但仅涉及20多种农药，且以有机氯、有机磷类农药为主，因此，建立一种灵敏度高、高选择性的人参中农药多残留分析方法具有重要意义。

目前，我国在用农药有800多种，农药的多样性与复杂性使其样品前处理方法成为分析关键[6-7]，已有农药残留检测的样品前处理方法主要为固相萃取法(SPE)[9]、液液萃取法(LLE)[10]、基质固相分散萃取法(MSPD)[11]、卢克(Luke)法[12]等，但这些方法存在检测种类单一、耗时、耗力且耗溶剂等局限。基于此，Anastassiades等[13],于2003年发明了一种集萃取和净化为一体的QuEChERS(Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe)前处理方法，样品经乙腈提取分离后加入NaCl和MgSO4等盐类除水，再加入PSA、C18等吸附剂除杂，该法又称为Original QuEChERS方法。随后，研究人员针对一些酸碱敏感的农药对该法进行了修改，其中一种采用醋酸钠缓冲盐提取体系的Acetate QuEChERS方法，于2007年成为美国分析化学家协会标准方法(AOAC 2007.01)；另一种采用柠檬酸缓冲盐提取体系的Citrate QuEChERS方法，于2008年成为欧洲标准化委员会标准方法(EN 15662)。上述3种QuEChERS方法均被广泛应用于蔬菜[14]、水果[15]、谷类[16]等食品中的农药多残留检测，但对于基质复杂的人参样品的检测鲜见报道[3,8,17-19]，因此，建立一种快速分析人参中农药多残留的分析方法具有重要意义。

已有研究表明，气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)[20-22]比气相色谱(GC)和气相色谱-质谱(GC-MS)更适合农残检测，这是因为GC-MS/MS采用二级MS离子定性，既可排除假阳性，又可提高检测灵敏度和准确性。基于此，本文依据GB/T 19506-2009《地理标志产品吉林长白山人参》及《中华人民共和国药典》2015版中涉及的农药目录，结合目前实际用于人参种植中的农药种类，选择有机氯、有机磷、菊酯类等41种代表性农药作为目标分析化合物，以QuEChERS方法为基础，建立了一种QuEChERS/GC-MS/MS检测人参中农药多残留的分析方法，并对实际样品进行了分析检测，结果令人满意。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TRACE 1300气相色谱-TSQ 8000 Evo三重四极杆质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，TD6M低速离心机(盐城市凯特实验仪器有限公司)，EVA 50A氮吹仪(北京普立泰科仪器有限公司)，QL-901涡旋振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

41种农药标准品溶液(100 μg/mL，农业部环境保护科研检验所)；内标：磷酸三苯酯(TPP，100 μg/mL，北京坛墨质检科技有限公司)；乙腈、乙酸乙酯、冰醋酸(色谱纯，美国Fisher Chemical公司)；无水硫酸镁(MgSO4)、无水氯化钠(NaCl)、无水醋酸钠(NaOAc)、N-丙基乙二胺(PSA)、柠檬酸钠(Na3C6H5O7)、柠檬酸氢二钠(Na2C6H6O7)(深圳逗点生物技术有限公司)；实验用水为色谱纯，购于德国CNW Technologies 公司。人参样品均购于本地商场和超市。

1.2 样品前处理

将人参样品60 ℃干燥后，粉碎至粉末状，均质，备用。

1.2.1 Original QuEChERS准确称取1 g(精确至0.000 1 g)样品于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL水，摇匀后浸泡15 min，再加入10 mL乙腈，涡旋振荡1 min，最后加入4 g 无水MgSO4和1 g NaCl，涡旋振荡1 min，于3 500 r/min离心10 min。精密移取6 mL有机层溶液至15 mL聚丙烯离心管中，加入150 mg PSA和900 mg 无水MgSO4，涡旋振荡1 min，于3 500 r/min离心5 min。

1.2.2 Acetate QuEChERS准确称取1 g(精确至0.000 1 g)样品于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL水，摇匀后浸泡15 min，再加入10 mL含1%(体积分数)冰醋酸的乙腈，涡旋振荡1 min，最后加入6 g 无水MgSO4和1.5 g NaOAc，涡旋振荡1 min，于3 500 r/min离心10 min。精密移取6 mL有机层溶液至15 mL聚丙烯离心管中，加入300 mg PSA和900 mg 无水MgSO4，涡旋振荡1 min，于3 500 r/min离心5 min。

1.2.3 Citrate QuEChERS准确称取1 g(精确至0.000 1 g)样品于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL水，摇匀后浸泡15 min，最后加入10 mL乙腈，涡旋振荡1 min，最后加入4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠，涡旋振荡1 min，于3 500 r/min离心10 min。精密移取6 mL有机层溶液至15 mL聚丙烯离心管中，加入150 mg PSA和900 mg 无水MgSO4，涡旋振荡1 min，于 3 500 r/min离心5 min。

上述3种QuEChERS程序完成后，精密移取2 mL上清液于10 mL离心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，残渣加入20 μL内标溶液和1 mL乙酸乙酯复溶，过0.22 μm微孔滤膜，转移至进样小瓶，待GC-MS/MS检测。

1.3 标准溶液的配制

内标(TPP)溶液：取1 mL 100 μg/mL TPP标准溶液于20 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，得5 μg/mL内标溶液，4 ℃冰箱中保存，备用。

混合标准溶液：分别取1 mL各农药标准溶液(100 μg/mL)于200 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀释定容至刻度，得0.5 μg/mL 41种农药混合标准溶液，4 ℃冰箱中保存，备用。

混合标准工作溶液：准确吸取一定体积的0.5 μg/mL混合标准溶液于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯依次稀释制得质量浓度为0.002、0.005、0.01、0.02、0.04、0.1 μg/mL的混合标准工作溶液。

基质匹配标准溶液：按照“1.2”方法前处理不含目标农药的“空白”人参样品，然后精密移取2 mL上清液至10 mL离心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，加入20 μL内标溶液，再分别加入0.002、0.005、0.01、0.02、0.04、0.1 μg/mL的混合标准工作溶液复溶，配成对应浓度的基质匹配标准溶液，过0.22 μm微孔滤膜，待测，现用现配。

1.4 气相色谱-串联质谱条件

色谱条件：色谱柱为TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm，美国Thermo Fisher Scientific公司)。进样口温度280 ℃。程序升温：初始温度40 ℃，保持1 min；然后以40 ℃/min升至120 ℃；再以5 ℃/min升至240 ℃；最后以12 ℃/min升至300 ℃，保持6 min；总运行时间为38 min。载气：高纯氦气(纯度≥99.999%)；恒流模式，流速为1.0 mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL。

质谱条件：接口温度为280 ℃，电离模式：电子轰击电离(EI)；轰击能量：70 eV；离子源温度：280 ℃;碰撞气：高纯氩气(纯度≥99.999%);溶剂延迟：5 min;选择反应监测(SRM)模式;Trace Finder工作站软件用于仪器控制与数据处理。41种农药及内标的保留时间、离子对信息及碰撞电压见表1。

表1 41种农药和内标化合物的化学式、保留时间、离子对及碰撞电压Table 1 Chemical formulas,retention times,ion pairs and collision energies of the 41 pesticides and internal standard

(续表1)

*quantitative ion pair(定量离子对)

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱条件优化

由于41种农药的分子极性相对较弱，因此选择极性较小的TG-5MS石英毛细管色谱柱进行分析，并通过优化柱箱的升温程序，使各农药能够有效分离。实验选择SRM模式下的两对离子对进行分析，一对用于定量分析，一对用于定性分析，并对目标农药的母离子、子离子、碰撞能量等质谱参数进行优化,确保每个目标农药色谱峰的采集点数量在15个左右，以满足响应值的要求。优化后41种农药的色谱-质谱参数见表1。

图1 空白人参样品基质的GC-MS/MS全扫描色谱图Fig.1 Full scan chromatograms of ginseng blank extract analysed by GC-MS/MS

2.2 前处理方法优化

为获得最佳的前处理方法，实验采用“空白”人参样品加标考察了Original、Acetate、Citrate 3种QuEChERS处理方法对人参中41种农药的提取效率和净化效果。结果显示，3种前处理方法的农药回收率差异显著，Original方法有97.6%的农药回收率为80%～120%，Acetate方法中农药的回收率大多集中在40%～60%之间，而Citrate方法中仅9.5%的农药回收率为80%～120%。为进一步了解差异性的原因，对经3种QuEChERS方法处理后的“空白”人参样品进行全扫描(Full scan)，结果见图1。由图可见，经Acetate方法处理的萃取液中，共萃取基质含量最多，其次为Citrate方法，而Original方法的共萃取基质含量最少。这是因为，Acetate和Citrate方法分别采用醋酸钠缓冲提取体系(pH=4.8)和柠檬酸钠缓冲提取体系(pH=5.1),两者的提取体系均呈弱酸性，且Acetate提取体系的pH值更低，使人参中部分基质化合物更易被共提取出来，从而增加了其共萃取基质含量，导致目标农药的回收率下降。因此，本研究选择Original QuEChERS前处理方法进行人参样品中41种农药的提取和净化。

2.3 基质效应

基质效应(Matrix effect，ME)是指样品中目标分析物以外的组分对目标分析物分析过程的离子化产生的抑制与增强作用[23-24]，基质效应=基质匹配工作曲线的斜率/纯溶剂中工作曲线的斜率，其比值越接近1，则表明基质效应越小，反之则表明基质效应越大。本研究经Original QuEChERS方法前处理后，仍有部分共萃取基质被提取，无法完全消除基质效应，影响分析结果的准确性，且以β-六六六(1.920)、腐霉利(1.679)、烯唑醇(1.753)、氟氰戊菊酯-1(2.322)、氟氰戊菊酯-2(2.427)的基质效应最为明显。因此，为降低基质效应的影响，采用基质匹配标准溶液进行校正。

2.4 方法学验证

2.4.1 标准曲线、检出限及定量下限取1.0 g“空白”人参样品，经“1.2”方法处理后，取2 mL上清液于10 mL离心管中，于40 ℃水浴中氮吹至干，加入20 μL内标溶液，再分别加入一定量标准工作溶液复溶，配成10、25、50、100、200 μg/kg的基质匹配标准溶液，过0.22 μm微孔滤膜，在优化条件下测定，并以各化合物的峰面积(y)为纵坐标，对应质量浓度(x)为横坐标，制作标准曲线，结果见表2。结果显示，41种农药在各自的浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.995。分别以信噪比(S/N)为3和10时计算方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，得41种农药的LOD和LOQ分别为2.0～6.0 μg/kg和5.0～20.0 μg/kg，完全满足人参中农药残留的测定要求。

表2 41种农药的线性范围、相关系数、加标回收率、相对标准偏差、检出限和定量下限Table 2 Linear ranges,correlation coefficients(r),recoveries,RSDs,LODs and LOQs of 41 pesticides

(续表2)

*the number and name of pesticide are identical to those in Table 1;-:no data

2.4.2 回收率与精密度取“空白”人参基质进行41种农药化合物的加标(10、20、100、200 μg/kg)回收实验，每个浓度平行实验6次，采用基质匹配外标法定量。结果显示，在4个加标水平下41种农药的回收率为86.7%～115%，RSD均小于15%(表2)。表明本方法灵敏度高、准确性好，可用于人参中41种农药的同时测定。

2.5 实际样品检测

采用本方法在优化条件下对本地超市和市场采集的50份人参样品进行测定。结果显示，2个样品检出甲基对硫磷，含量分别为42.9、73.1 μg/kg;1个样品检出氟虫腈和毒死蜱，含量分别为36.5 μg/kg和32.9 μg/kg;1个样品检出腐霉利，含量为36.7 μg/kg;1个样品中检出除草醚，含量为30.3 μg/kg;1个样品检出异丙甲草胺，含量为130.0 μg/kg，1个样品检出甲基异柳磷，含量为22.1 μg/kg。其余样品中41种农药均未检出。图2为一个阳性人参样品中检出异丙甲草胺农药残留的色谱图。

图2 人参样品中异丙甲草胺的离子色谱图Fig.2 Ion chromatograms of metolachlor in ginseng sample

3 结 论

本文建立了同时检测人参中41种农药残留的QuEChERS/GC-MS/MS分析方法，并对3种QuEChERS前处理方法进行了比较。结果显示，采用Original QuEChERS前处理方法时能够有效去除基质干扰，且97.6%的目标农药回收率在80%～120%之间，能够满足国内对农药残留检测中精密度和准确度的要求。该方法操作简单、高效、灵敏可靠，为人参中多农药残留的风险评估、检测等研究提供了一种高效、可靠的分析手段。