MIL－101（Cr）填充针头式过滤器固相微萃取/高效液相色谱法检测水中雌激素

邓鑫雨，魏皓东，庞月红，史学丽，张 毅*

（1.江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，食品学院分析食品安全研究所，江苏 无锡 214122；2.石家庄市妇幼保健院，河北 石家庄 050051）

内分泌干扰物（EDCs）因其对激素系统的干扰能力而得到广泛关注［1－2］。近年来，由于大量药物的生产和使用，越来越多的EDCs通过生产和生活废物、人类和其他生物的排泄物进入环境中，其中环境雌激素（EEs）种类最多、最受关注。大多数环境雌激素的化学性质稳定、半衰期较长，在生物体内降解速度慢、难以排出体外，并能通过食物链等作用在人体内富集，导致毒性蓄积，从而产生致癌、致畸性［3－4］。因此，监测环境中残留的雌激素具有重要意义。

由于环境样品的组成非常复杂且环境中雌激素的含量较低，通常需要进行样品前处理以浓缩分析物和减少干扰物［5］。填充吸附剂微萃取（Micro-extraction by packed sorbent，MEPS）是一种将吸附剂（1～4mg）封载于注射器针筒的小型化固相萃取技术，其吸附剂和有机溶剂用量少、操作简单、富集因子高、回收率高，已成功用于环境或生物基质中多种分析物的提取［6］。此外，吸附材料也是影响固相萃取效果的关键因素之一，与传统吸附材料相比，金属有机骨架（MOFs）具有易制备、孔径可调、比表面积大等优点，自2006年以来被广泛应用于不同形式的固相萃取中。MIL－101（Cr）是一种以对苯二甲酸铬为骨架的介孔MOFs，大孔笼（孔窗为12Å和14.7 ×16Å，内径为29Å和34Å）、高孔隙率、大比表面积和良好稳定性使其成为吸附和分离环境样品中分析物的有前途的候选物［7－8］。

本文以MIL－101（Cr）为吸附剂，在MEPS基础上，提出一种以带有微孔滤膜的针头式过滤器为吸附剂载体的小型化萃取方法——填充针头式过滤器固相微萃取（SPME－FSF），借助于注射器推动力在滤头内快速完成萃取、淋洗、洗脱过程，开发了一种简单、快速、高效、低成本的新型固相微萃取装置，并结合高效液相色谱－荧光检测器（HPLC－FLD）实现了环境水中雌二醇（E2）、雌三醇（E3）、雌酮（E1）的萃取和分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

D2PHASER X射线衍射仪（德国布鲁克有限公司）；SU8100冷场发射扫描电子显微镜（日本日立株式会社）；Autosorb－iQ全自动比表面和孔径分布分析仪（美国Quantachrome公司）；UV－3600PLUS紫外－可见分光光度计（日本岛津公司）；LSP02－1B注射泵（保定兰格恒流泵有限公司）。

17β-雌二醇（17β-E2）、雌三醇（E3）、雌酮（E1）、Cr（NO3）3·9H2O、对苯二甲酸（PTA）（上海阿拉丁生物技术有限公司）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、无水乙醇、氢氟酸、盐酸、氢氧化钠、溴化钾（国药集团化学试剂有限公司）；色谱纯乙腈、甲醇（美国Fisher Chemical公司）。所用试剂如未特别说明，均为分析纯。0.22 µm尼龙66过滤器（Ameritech Scientific公司）；PTFE过滤器（安捷伦科技有限公司）。湖水样品取于江苏无锡小蠡湖；自来水样品取自实验室；饮用水样品为桶装洞庭山饮用天然泉水，购于苏州碧螺天然泉食品饮料有限公司。

1.2 MIL－101（Cr）的合成

MIL－101（Cr）的合成参照Férey课题组的水热合成法［8］：将800mg Cr（NO3）3·9H2O（2.0 mmol）、332mg PTA（2.0 mmol）、9.6 mL水和0.1 mL氢氟酸（40%）超声分散均匀后于反应釜内220℃反应8h，冷至室温，离心并用DMF洗涤沉淀至洗涤液无色澄清透明，以除去孔道内的对苯二甲酸及金属盐溶液；以无水乙醇洗涤3次，置换孔道内残留的DMF，40℃真空干燥过夜，得MIL－101（Cr）固体。

1.3 固相微萃取滤头的构建

取50mg MIL－101（Cr）于容量瓶中，甲醇定容至10mL，超声使其分散均匀制成5g/L分散液，取1mL分散液注入带有0.22 µm滤膜的针头式尼龙过滤器，MIL－101（Cr）晶体被拦截于过滤器内，制成MIL－101（Cr）固相微萃取滤头。

模拟固相萃取过程，利用注射泵将10mL超纯水以2.5 mL/min速度推过MIL－101（Cr）固相微萃取滤头，注射器移取1mL甲醇推过该滤头，收集甲醇洗脱液。通过测量MIL－101（Cr）的紫外吸收光谱与水合粒径得到MIL－101（Cr）的特征峰，再通过测量滤液及洗脱液的紫外吸收光谱与其中颗粒的水合粒径，对MIL－101（Cr）固相微萃取滤头中尼龙滤膜的完整性进行表征。

1.4 萃取过程

SPME－FSF装置与萃取过程如图1所示。吸附：以注射器吸取10mL样品溶液，并以2.5 mL/min流速推过MIL－101（Cr）固相微萃取滤头；洗涤：以注射器吸取2mL10%（体积分数）甲醇/水推过萃取头；洗脱：吸取1mL甲醇推过萃取头，洗脱液以HPLC－FLD分析。

图1 填充针头式过滤器固相微萃取示意图Fig.1 Schematic illustration for SPME－FSF

分散固相萃取（DSPE）过程如下：吸附：取10mL样品溶液加至15mL离心管中，加入5mg MIL－101（Cr），超声10min；洗涤：10000r/min离心15min后弃上清液，以2mL10%甲醇/水超声10min；洗脱：离心弃上清液，沉淀以1mL甲醇超声10min，过0.22 µm滤膜，滤液待HPLC－FLD分析。

1.5 液相色谱检测条件

使用配备C18X Bridge柱（250mm×4.6 mm，5µm）和2475FLR检测器的e2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）进行HPLC－FLD分析。流动相：乙腈（A）和2%（体积分数）乙酸/水（B），梯度洗脱：0～7min，50% A；7～7.5 min，50%～100%A；7.5 ～10.5 min，100% A；10.5 ～11min，100%～50%A；11～12min，50%A。进样量为10µL，流速为1.0 mL/min，柱温保持在25℃；激发波长为280nm，发射波长为310nm。

2 结果与讨论

2.1 MIL－101（Cr）的表征

通过X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）、BET比表面积测试对MIL－101（Cr）进行表征（图2）。MIL－101（Cr）的XRD谱图（图2A）中所有衍射峰的位置和相对强度均与标准谱图一致；SEM图像（图2B）显示MIL－101（Cr）晶体为八面体形，粒径在1µm左右，与Lebedev等［9］报道的MIL－101（Cr）晶体和SEM图像一致，表明MIL－101（Cr）成功合成。

N2吸附－脱附等温线和孔径分布图（图2C、D）显示MIL－101（Cr）的比表面积为3366.20 cm2/g，孔体积为1.48 cm3/g。根据3D模拟软件已知3种雌激素的分子直径分别为11.0 Å、10.5 Å、12.2 Å（图2E），而MIL－101（Cr）呈介孔与微孔分布（图2D），孔径集中在11.4 Å、17.5 Å和30.9 Å，因此雌激素恰能进入MIL－101（Cr）内部。综上，MIL－101（Cr）超大的比表面积与孔体积以及合适的孔径大小非常有利于雌激素的萃取。

图2 MIL－101（Cr）的XRD谱图与模拟谱图对比（A）、SEM图像（B）、氮气吸附－脱附等温线（C）、孔径分布图（D），以及E2、E3、E1的分子结构（E）Fig.2 XRD pattern compared with simulated pattern（A），SEM image（B），nitrogen adsorption－desorption isotherms（C）and pore size distribution（D）of the as-synthesized MIL－101（Cr），and structures of E2，E3and E1（E）

2.2 固相微萃取滤头的构建

实验结果显示，将MIL－101（Cr）分散液填充入过滤器后，滤液与洗脱液澄清，说明大部分MIL－101（Cr）被截留在滤膜上且滤膜无破损。为进一步探究滤液及洗脱液中是否有MIL－101（Cr）渗出以验证滤膜完整性，对溶液紫外吸收光谱（图3A）与颗粒水合粒径（图3B）进行表征。如图所示，MIL－101（Cr）在307nm处有最大吸收峰，平均水合粒径为981nm，过滤液中检测到微量水合粒径为100～300nm的颗粒，可能是超声分散过程中有极少量的MIL－101（Cr）晶体破碎或溶解变小，得以通过0.22 µm孔径滤膜；洗脱液无大于10nm的颗粒存在，表明固相微萃取滤头中滤膜在2.5 mL/min流速和对应的压力下进行萃取后仍能保证完整，这有利于后续萃取过程中固相与液相的分离，实现对色谱柱的保护作用。

图3 MIL－101（Cr）的紫外吸收光谱图（A）及水合粒径图（B）Fig.3 UV absorption spectra（A）and hydrodynamic size（B）of MIL－101（Cr）a：MIL－101（Cr）dispersion；b：MIL－101（Cr）filtrate；c：eluent after SPME

通过研究DSPE与SPME－FSF方法对雌激素的萃取率证明该方法的有效性（图4A）。结果表明，与传统DSPE相比，自制固相微萃取装置的萃取效率提高了3～12倍。为进一步探究其萃取回收率显著提高的原因，分别采用空白Nylon过滤器、MIL－101（Cr）粉末以及填充有MIL－101（Cr）的Nylon过滤器、PTFE过滤器对3种雌激素进行萃取（图4B）。以E2为例，MIL－101（Cr）的DSPE回收率不足20%；PTFE滤膜对雌激素无明显吸附作用（数据未给出），但将吸附剂填充至PTFE过滤器后，E2回收率提高至60%，这可能是因为将吸附剂固定于过滤器内，易于固液相分离，减少了由于离心转移造成的样品与吸附剂损失。Nylon滤膜对E2有吸附作用，回收率约50%，与文献结果一致；基于填充有MIL－101（Cr）的Nylon过滤器SPME－FSF使回收率增加至约90%［10］。可见：SPME－FSF能通过减少操作损失提高回收率，而对分析物具有吸附作用的Nylon滤膜发挥了显著的协同增效作用。

图4 基于MIL－101（Cr）的DSPE和SPME－FSF方法对分析物的萃取效果（A）；Nylon过滤器、MIL－101（Cr）以及填充有MIL－101（Cr）的Nylon过滤器、PTFE过滤器对分析物的萃取效果（B）Fig.4 Extraction effect of DSPE and SPME－FSF on analytes based MIL－101（Cr）（A）；extraction effect of nylon filter，MIL－101（Cr），nylon filter and PTFE filter filled with MIL－101（Cr）on analytes（B）

2.3 萃取条件的优化

考察了洗脱剂、淋洗液、注射速度、离子强度、溶液pH值等条件对萃取效果的影响。实验过程使用加标的纯水样品（0.2 mg/L），固相微萃取滤头不重复使用，所有实验均重复3次。

2.3.1 洗脱剂为提高洗脱效率，解吸溶剂必须比吸附剂对分析物具有更高的亲和力［5］。实验选用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等溶剂作为洗脱剂对3种目标物进行洗脱。由图5A可见，以甲醇作洗脱剂时，3种分析物的洗脱效果明显优于其他溶剂，因此选择甲醇作为洗脱剂。

2.3.2 淋洗液合适的淋洗液能在减小基质影响的同时避免造成分析物的损失。选择不同浓度的甲醇/水、乙腈/水进行洗涤，结果表明（图5B）甲醇/水对分析物回收率的影响较小，为更有效去除样品中的脂溶性杂质，选取10%甲醇/水作为淋洗液。同时对淋洗液体积（1、2、3、10mL）进行了优化，发现当淋洗液体积为2mL时分析物的回收率最高。这可能是因为适当体积的淋洗液能在洗涤过程中去除干扰物，有利于后续的分析物洗脱，而当淋洗液体积过大时，部分分析物被淋洗液洗脱，导致回收率降低。因此，实验选择2mL10%甲醇/水作为淋洗液。

2.3.3 注射速度萃取过程中样品溶液通过滤头的速度影响分析物与吸附剂的接触时间，进而影响萃取效果。结果显示，流速小于2.5 mL/min时，3种分析物的回收率无显著差异，当注射流速大于2.5 mL/min时，因萃取时间缩短导致回收率下降。基于省时高效的目的，实验选择注射速度为2.5 mL/min。

2.3.4 离子强度水溶液中离子强度会影响分析物的水溶性以及辛醇－水分配系数［11］进而影响萃取效果，因此本实验通过在萃取前向溶液中加入不同量的NaCl，考察了NaCl含量为0、5%、10%、15%、20%和30%对萃取过程的影响（图5C）。结果表明，随着盐含量的增加，E3的回收率变化不大，但E2、E1的回收率显著降低，这可能是因为随着盐含量的增加，溶液粘度增加导致传质效率降低，且极性雌激素分子与盐分子发生了静电相互作用，导致分析物的回收率降低［12］。所以实验选择样品中不加盐，这也简化了萃取过程。

2.3.5 样品溶液pH值样品溶液的pH值决定了分析物的存在形式，因此是影响萃取效率的最重要因素之一。通过添加HCl或NaOH溶液调节样品pH值，考察了样品溶液pH值对3种分析物回收率的影响（图5D），结果显示，pH＞6.0 时，分析物的回收率随pH升高而逐渐降低。这是因为在适当的酸性条件下，雌激素为游离分子态，疏水作用、π－π相互作用、氢键相互作用等作用力的存在更有利于吸附；而在碱性条件下，分析物离子化导致回收率下降［13］。因此实验选择样品pH值为6.0 。

图5 洗脱剂（A）、淋洗液种类（B）、盐离子浓度（C）以及样品溶液pH值（D）对分析物回收率的影响Fig.5 Effect of elution solvent（A），washing solvent（B），salt concentration（C）and sample pH（D）on the extraction recoveries for analytes

2.4 方法验证

在最佳萃取条件下，配制一系列质量浓度的雌激素标准溶液，采用本方法进行分析，并以目标物的质量浓度（x，µg/L）为横坐标，以峰面积（y）为纵坐标作图，得到3种雌激素的标准曲线。结果表明，E2、E3的线性范围为0.2 ～500µg/L，检出限（S/N=3）分别为0.05 、0.06 µg/L，定量下限（S/N=10）分别为0.16 、0.20 µg/L；E1因荧光信号弱导致检出限较高（1.50 µg/L），线性范围为5～500µg/L；3种雌激素的相关系数（r2）为0.9982 ～0.9993 （见表1）。使用相同方法制备的固相微萃取滤头对3种雌激素进行分析，以日内（n=6）、日间（n=3）的相对标准偏差（RSD）对不同滤头间的精密度进行验证，日内和日间RSD为0.20 %～6.1 %，证明该方法具有良好精密度。

表1 本方法的线性关系、检出限、定量下限及相对标准偏差Table1 Linear relations，detection limits，quantitation limits and RSDs of the proposed method

2.5 方法对比

表2对本方法与文献报道的其他固相萃取方法进行了比较，结果显示，本方法具有萃取装置简单、成本低、吸附剂用量少（5mg）、耗时短（萃取时间4min）、灵敏度高等优点。

表2 本方法与文献报道测定方法的比较Table2 Comparison of the proposed method with reported methods for the analysis of E2，E3and E1

2.6 实际样品的检测

在最优条件下，将本方法应用于自来水、饮用水和湖水样品中3种雌激素的检测，3种样品中均未检出目标物。图6为实际湖水样品、加标湖水样品与雌激素标准溶液的色谱图。为验证本方法在实际样品分析中的准确性，对上述3种实际样品进行加标回收实验，所有分析物的回收率为84.1%～108%，RSD不大于5.5%（见表3）。

图6 实际湖水样品（a）、加标湖水样品（b）与标准溶液（c）的色谱图Fig.6 Chromatograms of lake water sample（a），spiked lake water sample（b）and the standard solution of estrogens（c）b：spiked10µg/L for E3and E2，100µg/L for E1；c：10µg/L for E3and E2，100µg/L for E1

表3 实际样品中E2、E3、E1的检测值及加标回收率（n=3）Table3 Analytical results and recoveries of estrogens in real samples（n=3）

3 结 论

本文通过水热合成法成功制备了MIL－101（Cr）并将其填入针头式尼龙过滤器，构建了一种简单、高效、低成本的固相微萃取装置，结合HPLC－FLD建立了水样中3种雌激素的检测方法。开发的固相微萃取装置具有操作简单、吸附剂用量少、成本低、耗时短等优点，所建立的分析方法线性范围宽、灵敏度较高，回收率和精密度较好，适用于水样中雌激素的筛查与确证。