超高效合相色谱法对克伦特罗对映体的拆分及其在猪尿中的残留分析

张文华，侯建波，荣杰峰，汪 鹏，谢 文，徐敦明，李 可，郗存显，韩 超

（1.杭州海关技术中心，浙江 杭州 310016；2.厦门海关，福建 厦门 361001；3.重庆海关技术中心，重庆400020；4.浙江树人大学，生物与环境工程学院 浙江 杭州 310015）

克伦特罗，俗称“瘦肉精”，是一种选择性β2受体激动剂，含有1个手性中心［1］，存在一对对映体，分别为（+）－克伦特罗和（－）－克伦特罗（图1）。人工合成的克伦特罗以外消旋体形式为主，克伦特罗能够改变牲畜体内养分的代谢途径，促进动物肌肉生长，加速牲畜体内脂肪的分解代谢，促进骨骼肌蛋白质的合成，提高动物的瘦肉率［2－3］。但在动物组织中的克伦特罗残留已发生多次中毒事件，引起了人们的高度重视。近年来，克伦特罗在中国已被禁止作为生长促进剂使用。关于克伦特罗残留的危害及分析已有不少文献报道［4－5］，由于不同结构对映体存在不同的毒性、药理活性和代谢差异［6－7］，然而大多数的文献在分析克伦特罗危害时，通常不能精确评估克伦特罗两个对映体的具体危害，将其视为同一物质来对待，必然导致对其危害评估不准确。为了进一步研究克伦特罗对映体之间的生物活性差异，迫切需要建立一种克伦特罗对映体的高效分离分析方法。

目前，高效液相色谱法［8-9］、毛细管电泳法［10-11］、液相色谱－串联质谱法［12－15］等方法被广泛用于克伦特罗对映体的分析。但这些方法通常存在分离度不佳、分析时间过长、色谱峰形较差、有机试剂用量大等问题。近年来超高效合相色谱法（UPC2）受到了广泛关注，该技术将传统超临界流体色谱技术（SFC）与超高效液相色谱技术（UPLC）的优势相互补充［16］，利用超临界CO2与少量有机试剂（甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇等）为流动相，通过精确调节两种流动相之间的比例、系统动态背压和柱温获得所需的系统分辨率，从而精确调控目标化合物对映体的分离度和保留时间，在手性分离上具有显著的优势而被广泛应用［17］。近年的研究显示，相比传统色谱技术，UPC2技术更适合于分析传统液相色谱难以分离的手性对映体及类似物，并已被广泛应用于酚酸类化合物［18］、三唑类农药［19］、酚类精油［20－21］、色素［22］、甘油三酯［23］等的分离。目前，UPC2技术应用于克伦特罗对映体的拆分及含量测定未见报道。

本研究建立了超高效合相色谱法拆分和测定克伦特罗对映体的方法。实验优化了克伦特罗对映体的仪器色谱分离条件和猪尿中克伦特罗对映体的净化条件，并对所采购的克伦特罗外消旋体标准品进行拆分，对猪尿样品中克伦特罗对映体的含量进行测定。该方法具有分离效果好、分析速度快、有机溶剂用量少等特点，可为进一步研究克伦特罗的药理和开发副作用更小的新药提供技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

超高效合相色谱仪（美国Waters 公司）；台式离心机（美国Thermo 公司）；AE260 电子天平（瑞士Mettler公司）；R215旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；超纯水净化系统（英国Elga公司）；MS2涡旋混匀器（上海医大仪器厂）；氮吹仪（日本东京理化公司）；S220酸度计（瑞士Mettler公司）。

聚合物固相萃取小柱（Oasis HLB 3 mL，60 mg，杭州金谱科学仪器有限公司）；混合型强阳离子交换固相萃取柱（Oasis MCX 3 mL，60 mg）、混合型弱阳离子交换固相萃取柱（Oasis WCX 3 mL，60 mg）（美国Waters 公司）；混合型阳离子交换固相萃取柱（Agela PCX 3 mL，60 mg，天津博纳艾杰尔公司）；柱子使用前依次采用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 10 mmol/L盐酸对其进行活化。

手性分离色谱柱：多糖衍生物耐溶剂型手性色谱柱CHIRALPAK IA－3（4.6 mm×100 mm，3µm），（大赛璐药物手性技术（上海）有限公司）。

克伦特罗外消旋体（CAS 号：129138－58－5，纯度≥98.0%，BePure 公司）。两种克伦特罗对映体：（+）－克伦特罗、（－）－克伦特罗（纯度均大于98.0%，上海勤路生物技术有限公司）。乙腈、甲醇、甲酸、乙醇、异丙醇、正庚烷（色谱纯，西班牙Scharlau 公司）；醋酸铵（分析纯，广东光华科技股份有限公司）、氨水（分析纯，杭州高晶精细化工有限公司），氢氧化钠（分析纯，西陇科学股份有限公司）；水为超纯水；其他实验所用试剂除特殊说明外均为分析纯。

1.2 标准储备液及工作液的配制

1.2.1 外消旋体标准储备液准确称取0.01 g（精确至0.1 mg）克伦特罗外消旋体标准品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的标准储备液。

1.2.2 对映体标准储备液分别准确称取0.01 g（精确至0.1 mg）（+）－克伦特罗和（－）－克伦特罗标准品，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的克伦特罗对映体标准储备液。

克伦特罗对映体的混合工作溶液：准确吸取一定量的标准储备液，用正庚烷逐级稀释成50、100、200、1 000、5 000、10 000µg/L的混合工作溶液。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品提取准确吸取10 mL猪尿于50 mL塑料离心管中，加入20 mL 0.02 mol/L醋酸铵溶液，涡旋混匀后，加入2.5 mL 50%三氯乙酸溶液，涡匀，8 500 r/min离心5.0 min，过滤，分别采用20 mol/L和2 mol/L 氢氧化钠溶液调节滤液pH 值至10.0 ± 0.05，加入20 mL 乙酸乙酯，涡匀，4 700 r/min 离心3.0 min，取上层清液于100 mL浓缩瓶中。重复提取一次，合并有机相，浓缩至干，用3 mL 2%甲酸水溶液溶解，待净化。

1.3.2 净 化取待净化溶液于活化好的PCX阳离子固相萃取柱中，上样后，依次用3 mL 2%甲酸水溶液和3 mL 甲醇淋洗，弃去淋洗液，抽干后，用6 mL 氨水－甲醇溶液（1∶19，体积比）洗脱，在40 ℃水浴中氮气吹干上述洗脱液，待试管冷却后准确加入0.2 mL正庚烷复溶，涡匀，过0.22µm 有机系滤膜后，再装入有内衬管的进样小瓶中，待测。

1.4 分析条件

色谱柱：CHIRALPAK IA－3（4.6 mm×100 mm，3µm）；流动相：A 为CO2，B 为含10 mol/L 醋酸铵的甲醇溶液（0.5∶99.5，体积比，下同）；梯度洗脱程序：0～2.0 min，7%B；2.0～2.1 min，7%～20%B；2.1～6.0 min，20%B；6.0～6.1 min，20%～7%B；6.1～8.0 min，7%B；系统背压：13.8 MPa；流速：2.0 mL/min；进样量：10µL；柱温：40 ℃；检测波长：241 nm。

1.5 梯度分离条件

梯度分离条件1：0～2.0 min，7% B；2.0～2.1 min，7%～20% B；2.1～4.0 min，20% B；4.0～4.1 min，20%～7%B；4.1～6.0 min，7%B。

梯度分离条件2：0～2.0 min，7% B；2.0～2.1 min，7%～20% B；2.1～5.0 min，20% B；5.0～5.1 min，20%～7%B；5.1～8.0 min，7%B。

梯度分离条件3：同“1.4”。

梯度分离条件4：0～2.0 min，5% B；2.0～2.1 min，7%～25% B；2.1～6.0 min，25% B；6.0～6.1 min，25%～7%B；6.1～8.0 min，7%B。

2 结果与讨论

2.1 系统背压的选择

UPC2采用超临界状态的CO2作为流动相，通过系统背压和温度的调整可有效改变CO2的密度，从而改变其对物质的溶解能力、洗脱能力和选择性。由于CO2只有温度超过31 ℃且压力超过7.38 MPa，才会进入超临界CO2状态。因此本实验以10 mol/L 醋酸铵－甲醇溶液（0.5∶99.5）作为助溶剂，在柱温40 ℃下考察了4 种不同系统背压（10.3、13.8、17.2、20.7 MPa）对克伦特罗对映体分离的影响（见图2）。结果显示，随着系统背压的升高，分析物的保留时间提前。4种条件下，2种克伦特罗对映体在系统背压13.8 MPa时色谱峰形和分离度均达到最佳。综合考虑保留时间、峰形及系统压力，本研究选择系统背压为13.8 MPa。

图2不同系统背压对（+）－克伦特罗和（－）－克伦特罗对映体分离效果的影响Fig.2 Effects of different of system back pressures on separation of（+）－clenbuterol and（－）－clenbuterol

2.2 定容试剂的选择

考察了5种定容试剂（甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、正庚烷）对10 mg/L克伦特罗对映体的拆分效果（如图3）。结果显示，当采用甲醇和乙醇作为定容试剂时，目标物的峰形和分离度较差；当采用乙腈、异丙醇和正庚烷作为定容试剂时，2种克伦特罗对映体的色谱峰均在6.0 min内实现了完全分离，但相比于异丙醇和乙腈，采用正庚烷作为定容试剂时，目标物的色谱峰分离度更好，峰形更尖锐。因此，最终确定正庚烷为定容试剂。

图3 不同定溶剂对（+）－克伦特罗和（－）－克伦特罗分离效果的影响Fig.3 Effects of different constant volume reagents on separation of（+）－clenbuterol and（－）－clenbuterol

2.3 不同梯度分离条件的影响

为了获取最佳的梯度分离条件，本文以CO2（A）与醋酸铵－甲醇溶液（0.5∶99.5，B）为流动相，分别采用“1.5”中不同梯度分离条件考察了（+）－克伦特罗和（－）－克伦特罗的分离效果。由图4 可见，采用梯度分离条件4时，两种克伦特罗对映体未完全分离，其他3种梯度分离条件可实现两种对映体的完全分离，且以梯度分离条件3时两种对映体的色谱峰形和基线最佳，故本实验采用梯度条件3。

图4 不同梯度条件对（+）-克伦特罗和（-）-克伦特罗分离效果的影响Fig.4 Effects of different gradient conditions on separation of（+）-clenbuterol and（-）-clenbuterol

2.4 净化条件的优化

对比了HLB、MCX、PCX 和WCX 固相萃取柱对猪尿中克伦特罗对映体的净化效果（见图5）。结果表明，采用HLB 和WCX 柱净化时，克伦特罗对映体在“1.3.2”淋洗条件下几乎全部流失，造成洗脱液中剩余目标物含量较少，回收率低。采用MCX 和PCX 柱净化时，2 种克伦特罗对映体的回收率均达86.0%以上，且PCX 柱净化时，杂质峰对（－）－克伦特罗的干扰更小。因此，本实验选择PCX 柱作为最佳固相萃取柱。

图5 固相萃取柱对(+)－克伦特罗和（-）-克伦特罗净化效果的影响Fig.5 Effects of solid phase extraction columns on the purification and recoveries of（+）－clenbuterol and（－）－clenbuterol

2.5 线性范围与定量下限

将（+）－克伦特罗和（－）－克伦特罗的系列混合标准溶液按上述色谱条件进行测定。以标准品的峰面积为纵坐标，对应的质量浓度为横坐标。结果表明，两种对映体均在50～10 000µg/L 质量浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数（r2）分别为0.999 9、0.999 8。通过在不含有克伦特罗的猪尿空白样品中添加标准品，按照本方法进行测定，以信噪比（S/N）=10 计算定量下限（LOQ），得到两种对映体的LOQ均为1.0µg/L。

2.6 回收率与相对标准偏差

采用分别在不含克伦特罗的猪尿空白样品中添加标准溶液的方法进行回收率和相对标准偏差（RSD）的测定，两种克伦特罗对映体的加标水平分别为1.0、5.0、20.0 µg/L，每浓度水平平行测定6 次，计算加标回收率及相对标准偏差（RSD），结果见表1。两种克伦特罗对映体的回收率为76.4%～94.5%，相对标准偏差（RSD，n=6）为3.6%～6.6%。该回收率和RSD 符合SN/T 0001－2016［24］的要求，能够满足猪尿样品的分析要求，可用于日常检测。

表1 猪尿空白样品中2种克伦特罗对映体的加标回收率和相对标准偏差（n=6）Table 1 Spiked recoveries and relative standard deviations of 2 kinds of clenbuterol stereoisomers in swine urine（n=6）

2.7 方法的应用

2.7.1 实际样品的测试为了考察本方法的有效性和实用性，应用所建立的方法对20 份从养猪场抽取的猪尿样品中（+）－克伦特罗和（－）－克伦特罗的含量进行测定。结果显示，20份猪尿样品中均未检出（+）－克伦特罗和（－）－克伦特罗。

2.7.2 外消旋体标准品的拆分采用本方法对所采购的克伦特罗外消旋体标准品进行拆分及测定，如图6 所示，2 种克伦特罗对映体在6.0 min 内实现有效拆分，色谱峰的保留时间顺序依次为：（+）－克伦特罗、（－）－克伦特罗。根据上述绘制的标准曲线，采用外标定量法计算克伦特罗外消旋体标准品中两种克伦特罗对映体的含量，其中（+）－克伦特罗的含量为5.6 mg/L，（－）－克伦特罗的含量为5.5 mg/L。该计算结果与文献报道工业品克伦特罗外消旋体中（+）－克伦特罗与（－）－克伦特罗的比例为1.02∶1.00基本相符［13］。

图6 克伦特罗外消旋体拆分的色谱图Fig.6 Chromatograms for separation of standard clenbuterol racemate

3 结 论

本文优化了猪尿样品中克伦特罗对映体的净化方法、分离条件等主要参数，建立了超高效合相色谱法拆分克伦特罗对映体及测定其在猪尿中含量的分析方法。同时还利用所建立的优化方法对克伦特罗外消旋体标准品和实际猪尿样品进行分析测定。研究结果表明，本方法具有分离效果好、分析速度快、绿色环保、灵敏度高等特点，能够满足猪尿样品中克伦特罗对映体含量测定的需求。