基于金纳米粒子的光学生物传感方法研究进展

廖小飞，赖余芬，凌连生，邹 李*

(1.广东药科大学 药学院，广东 广州 510006；2.中山大学 化学学院，广东 广州 510275)

金纳米粒子(Gold nanoparticles，AuNPs)是近些年研究最为广泛的纳米材料之一，主要采用柠檬酸钠还原法合成，通过控制成核制备不同粒径的AuNPs[1-3]。由于AuNPs的表面等离子体共振性质，不同粒径的AuNPs会呈现出不同颜色，这为AuNPs的应用奠定了科学基础[4-5]。AuNPs不仅制备过程简单，拥有独特的光电效应，还具有较大的比表面积和良好的生物相容性，使得修饰在其表面上的生物分子可以保持良好的活性。利用某些官能团(如巯基、氨基等)与AuNPs表面具有的较强亲和力，可将生物分子(如核酸、蛋白质和抗体等)修饰到AuNPs表面上，以AuNPs探针作为分子识别元件，可以构建多种形式的生物传感方法[6-7]。

自1962年Clark首次提出生物传感的概念以来，生物传感技术得到了快速发展[8]。根据信号转换的不同，可分为电化学生物传感[9]、光学生物传感[10]、热学生物传感[11]、场效应管生物传感[12]和压电晶体生物传感[13]等。其中，光学生物传感是将分析物与分子识别元件之间反应产生的信号，转化成可供检测的光学信号，从而实现对目标物的分析检测[14]。鉴于AuNPs具有独特的光学性质，因而被广泛应用于光学生物传感方法的构建。基于AuNPs的光学生物传感方法具有特异性好、灵敏度高、响应快速、操作简便、可现场即时监测等优点，在药物分析[15]、医学检验[16]、环境监测[17]及食品安全[18]等领域的快速检测中具有广阔的应用前景。本文综述了近年来基于AuNPs的比色生物传感法、荧光生物传感法、电化学发光生物传感法和光散射生物传感法的研究进展(图1)，旨在为基于AuNPs的光学生物传感方法的进一步发展应用提供参考。

1 基于AuNPs的比色生物传感法

AuNPs能在可见光区产生表面等离子体共振(SPR)吸收，且吸收峰的位置与颗粒之间的距离及粒径大小有关[19]。当颗粒间的距离小于AuNPs的粒径时，颗粒会发生团聚，其SPR吸收峰发生红移，同时AuNPs溶液由红色变为蓝色，由此可构建出各种形式的比色生物传感方法[20]。未经修饰的裸AuNPs具有较高的表面自由能而导致其稳定性较差，单链DNA(ssDNA)可通过静电力吸附在AuNPs表面形成保护层，防止AuNPs在高离子强度下发生团聚。而双链DNA (dsDNA)具有刚性结构，不易吸附在AuNPs表面，在高离子强度下AuNPs周围的双电层被破坏，使AuNPs发生团聚[21]。根据AuNPs对单双链DNA的吸附力不同，Kim等[22]将土霉素的适配体吸附在AuNPs表面上防止其团聚，当土霉素存在时，适配体会与其特异性地结合而从AuNPs表面解离，失去适配体保护的AuNPs发生聚集显色变化。Liu等[23]设计了2个带有ssDNA粘性末端的发夹辅助探针，可以有效地稳定AuNPs，当靶DNA存在时可触发2个发夹辅助探针发生级联杂交反应，形成带缺口的长链状dsDNA。新形成的dsDNA聚合物没有ssDNA粘性末端，当盐离子浓度增加时，AuNPs发生聚集，呈现红色到蓝色的颜色变化。以上策略通过简单的静电吸附作用，无需复杂和昂贵的AuNPs表面修饰即可实现检测分析的应用，但该法选择性较差，易受外界干扰导致稳定性不够理想。

AuNPs可以通过Au-S键与带巯基的ssDNA牢固结合，以此作为探针与目标DNA发生特异性杂交反应，拉近AuNPs之间的距离而发生团聚。溶液颜色由红色变为蓝色，相应的SPR吸收峰也发生红移[24]。Lee等[25]将2条ssDNA通过Au-S键修饰到AuNPs表面作为探针，利用T-Hg2+-T错配来诱导2种AuNPs探针结合，使AuNPs发生团聚，导致溶液颜色由红色变为蓝色，从而实现对Hg2+的可视化检测。为进一步提高AuNPs比色传感法的灵敏度，Ling课题组通过引入多种核酸放大技术，开发了一系列高灵敏的比色生物传感方法：①基于聚合酶链反应(PCR)产物可诱导DNA功能化的AuNPs组装成交联网状结构，建立了一种灵敏、通用的DNA检测方法[26]；②以DNA修饰的AuNPs为探针，利用脱氧核酶催化切割和杂交链式反应(HCR)双重放大技术，通过DNA杂交反应将AuNPs-DNA探针组装到HCR产物上，构建了一种高灵敏度的比色传感平台，并用于血清中乙酰胆碱酯酶活性分析及其抑制剂的筛选[27]；③将目标物驱动的催化发夹组装(CHA)技术与AuNPs-DNA探针相结合，设计了一种可用于复杂体系的无酶比色传感方法[28]。通常，生物标志物微量存在于人体中，利用比色法直接检测的效果往往不理想，通过引入各种核酸放大技术可将检测信号放大，提高灵敏度，避免假阴性。此外，AuNPs除了常与核酸适配体结合之外，还能与蛋白质通过静电吸附或共价键结合用于免疫标记，其中胶体金标记层析法是通过将抗原或抗体固定到AuNPs表面，抗原和抗体的特异性结合会导致AuNPs大量聚集，通过肉眼即可观察到明显的颜色变化。此法目前已发展成为诊断试纸条，使用十分方便[29-30]。

基于AuNPs的比色生物传感法是目前研究应用最为广泛的光学生物传感方法之一，其具有可视化、操作方便、能够现场快速实时检测等优势，但易受体系中离子浓度、pH值、温度、颜色背景等的影响，导致结果的稳定性和重现性较差。在未来的运用中可以引入更多的信号放大或输出方式，以提高其检测能力和扩大应用范围。

2 基于AuNPs的荧光生物传感法

AuNPs具有较高的消光截面和表面电子密度的性质，当荧光基团与其接近时，可通过偶极表面相互作用使荧光基团的能量有效转移到AuNPs表面使荧光猝灭[31]。荧光生物传感法是根据识别探针与待测底物之间的荧光共振能量转移(FRET)，并伴随着荧光信号的强弱变化及谱带迁移，可以实现对待测物质的间接分析检测[32]。Lv等[33]在赭曲霉毒素A(OTA)适配体的5'-端标记羧基荧光素，以AuNPs作为荧光猝灭剂，当体系中无OTA存在时适配体被吸附在AuNPs表面，其荧光信号被AuNPs猝灭。当体系中存在OTA时适配体与OTA结合形成折叠结构，可抵抗AuNPs的吸附从而恢复荧光信号。由于在适配体上标记荧光物质具有操作繁琐和成本较高的缺点，Zhou等[34]直接将甲胎蛋白(AFP)适配体修饰的发光CdTe量子点(CdTe QDs)作为供体，抗AFP抗体修饰的AuNPs作为受体，设计了通过二者之间荧光共振能量转移来检测AFP的免标记荧光生物分析方法。

另外，在生物传感体系中采用双重或多重信号输出的方式可以进一步提高检测分析的准确性[35]，Shi等[36]提出了一种基于碳量子点(CQDs)和AuNPs的比色和荧光双检测的纳米传感系统，可用于人血清中谷胱甘肽(GSH)的检测。其中CQDs作为荧光指示剂，AuNPs作为比色指示剂和荧光猝灭剂，在AuNPs溶液中加入CQDs后会引起AuNPs聚集显色，CQDs荧光猝灭。然而，当GSH存在时可以保护纳米粒子不聚集，扩大粒子间距离，从而产生颜色变化和荧光信号恢复。该生物传感器简单灵敏，制备的纳米粒子无需表面功能化，且对GSH有高度选择性，检出限(LOD)低至50 nmol/L。由于荧光具有很强的穿透性，在细胞或者微生物的成像检测方面也有巨大的应用优势[37]，Wu 等[38]设计了一种新型的静电DNA纳米组装结构，并将其用于活细胞内mRNA的超灵敏成像分析。DNA纳米组装结构由AuNPs、阳离子肽夹层以及荧光基团标记的发夹DNA探针利用静电作用组装，通过不依赖胞吞作用的独特机制，DNA 纳米组装结构能够克服溶酶体的捕获，使DNA探针的细胞转运效率较高。细胞内的mRNA则可以引发由静电作用组装的DNA探针从纳米组装结构中释放，再通过杂交链式反应提供足够的信号放大，实现mRNA表达的超灵敏荧光检测。

在基于AuNPs的荧光生物传感体系中，AuNPs通常作为荧光猝灭剂，可以猝灭各种荧光素或纳米材料的荧光信号。与比色检测方法相比，其能够排除有色样品的背景干扰，具有更高的灵敏度和抗干扰能力，使其成为分析化学领域的一个研究热点。

3 基于AuNPs的电化学发光生物传感法

AuNPs不仅有独特的光学性质，还具有良好的电子传递能力和催化活性，将AuNPs修饰到工作电极表面上可以催化电化学反应，以此提高电子的转移速率和增强发光信号[39]。电化学发光(ECL)是指在电极表面通过电化学反应实现电子转移，促使物质形成激发态，再由激发态向基态跃迁并发光[40]，故通常需加入化学发光剂，如有机小分子(鲁米诺及其衍生物等)[41]、金属有机配合物(三联吡啶钌及其衍生物等)[42]和量子点[43]等参与反应。与普通化学发光相比，基于AuNPs的ECL传感方法可实现反应可控、信号放大及重复使用，在核酸分子、蛋白质、病原体、细胞等检测中的应用更为广泛。Cao等[44]用AuNPs功能化的氧化石墨烯(GO@AuNPs)、葡萄糖氧化酶(GOx)与链霉亲和素(SA)对鲁米诺基ECL系统进行研究，构建了一种新型的竞争性ECL检测方法。在电极上修饰AuNPs可获得较强的初始ECL信号，再将GOx和SA-DNA加载到GO@AuNPs上制备信号探针，用于实现信号放大。在无目标物的情况下，通过适配体与SA-DNA的杂交反应，可将信号探针附着在电极上。在这种状态下，负载在探针上的GOx可以催化葡萄糖产生H2O2，然后AuNPs催化H2O2生成活性氧来氧化鲁米诺发光。在此基础上，Cao等[45]进一步设计了一种以硫化镉@纳米金-石墨相氮化碳(CdS@Au-g-C3N4)为光活性基质，氧化石墨烯-硫化铜@抗体(GO-CuS@Ab)复合物作为信号放大标记的三明治型ECL免疫传感系统。其中，AuNPs作为等离子体光敏剂和电子继电器，可以显著促进对光的吸收，加速g-C3N4和CdS之间的电荷转移。Cao等构建的两种ECL检测方法已成功用于前列腺特异性抗原(PSA)的检测，检出限均低于1 pg/mL。

ECL生物传感法结合了电化学与化学发光的优点，具有灵敏度高、稳定性高、可控性好、检测时间短、检测范围宽等特点。与荧光生物传感法相比，ECL生物传感法无需外界的光源激发，而是在电极表面实时原位产生光信号，因此消除了光散射和自发光的背景干扰，使得检测结果更为准确，已发展成为一个非常活跃的研究领域。

4 基于AuNPs的光散射生物传感法

AuNPs除了具有SPR吸收，颗粒之间还存在长程的等离子体共振耦合作用，使AuNPs间隙的局域电磁场会显著增强，从而导致拉曼信号明显增强[48]。通常待测物质自发的拉曼散射信号非常弱，但当其固定在粗糙金属表面时存在电荷转移，可以显著增加其拉曼散射强度[49]。基于AuNPs的表面增强拉曼散射(SERS)传感方法可通过捕捉AuNPs自身拉曼散射强度的变化来间接检测目标物。Lu等[50]将抗体修饰在AuNPs表面，设计了一种利用AuNPs表面增强共振拉曼散射的免疫层析条，可以快速、灵敏地检测血清中的抗原物质，此法比常规酶联免疫吸附法的检出限低10倍，具有潜在的临床应用价值。Fu等[51]通过在AuNPs表面修饰寡核苷酸和孔雀石绿异硫氰酸酯(MGITC)，作为SERS纳米标记并用于常规层析条上，由于MGITC具有很强的拉曼增强效应而被用作拉曼报告分子。该法通过记录测试线上的拉曼强度变化对目标物进行定量检测，比直接使用裸AuNPs的拉曼信号更加灵敏，比传统比色或荧光检测方法的灵敏度至少高1 000倍。

SERS信号强烈依赖于分析物分子与金属纳米结构间的相互作用和距离[52]，Hu等[53]将AuNPs嵌入金属-有机骨架(MOF)中用于高灵敏度的SERS检测，合成的金纳米粒子/拉瓦锡骨架(AuNPs/MIL-101)纳米复合材料结合了AuNPs的局域SPR特性和MOF的高吸附能力，当分析物接近活性金属表面时电磁场发生明显改变，使其成为高度敏感的SERS衬底。另外，通过将AuNPs组装到物质界面上也可形成良好的表面增强拉曼基底，极大提高检测灵敏度[54]。Zhu等[55]直接将AuNPs修饰到聚二甲基硅氧烷薄膜上，采用巯基苯甲酸和适配体修饰的金银核壳纳米粒子(Au@AgNFs)作为信号探针，在目标物存在的情况下，通过形成底物-目标物-分子探针的三明治结构实现精准检测。在实际样品检测中，拉曼光信号往往会受到其他成分的干扰，Zhang等[56]则提出了一种以四氧二铁酸钴@埃洛石纳米管/金纳米粒子(CoFe2O4@HNT/AuNPs)为基底，采用磁固相萃取技术测定化妆品中禁用添加剂的灵敏SERS传感方法。该法能有效简化实际样品的预处理，增强拉曼信号，减少样品基质的影响。

在光散射技术中，除了拉曼散射外，动态光散射(DLS)也被广泛应用。DLS是基于粒子的布朗运动引起散射光强度波动，来确定其尺寸大小和粒径分布。利用功能化的AuNPs探针特异性捕获目标物，诱导AuNPs发生聚集，从而可以通过DLS实现对目标物快速灵敏的检测[57-58]。Dai等[59]基于DLS技术设计了一种可单步检测DNA的方法，即当2个DNA功能化的AuNPs探针混合在含有互补靶DNA的样品溶液中时，靶DNA与2个纳米粒子探针杂交，导致纳米粒子形成二聚体、三聚体和多聚体，然后通过DLS技术进行检测。该法简单实用，但缺少必要的信号放大过程，为了进一步提高DLS检测的灵敏度，Ling课题组开发了一系列动态光散射结合核酸放大技术的生物传感策略，首先构建了聚合酶链式反应-动态光散射(PCR-DLS)的生物传感方法，用于艾滋病病毒(HIV)的灵敏检测，即当目标DNA存在时会使PCR过程中引物的发夹结构打开，生成的PCR产物两端带ssDNA片段，进一步与DNA修饰的AuNPs探针发生杂交，诱导AuNPs发生聚集使其粒径增大，DLS测量的粒径会随着目标DNA浓度的增加而增大[60]；还构建了杂交链式反应-动态光散射(HCR-DLS)和催化发夹自组装-动态光散射(CHA-DLS)的无酶生物传感方法，可用于肿瘤细胞中端粒酶的高灵敏检测[61-62]。

与传统比色法相比，基于AuNPs的光散射生物传感法克服了检出限高、有色底物的背景干扰、难以获取微量聚集信号等缺陷，具有无损快速、灵敏度高、重现性好、测量范围广及易于操作等优势，在核酸、多肽、抗体、细胞和微生物等生化分析中具有很好的应用价值，已在传感领域中越来越受到关注。总之，基于AuNPs的光学生物传感方法各具特色，在实际运用中需要根据具体的检测目标物并结合AuNPs的相关性质予以考虑。表1总结了此文所涉及的各类光学生物传感方法的相关应用情况。

表1 基于AuNPs的光学生物传感方法在分析检测中的应用Table 1 Applications of AuNPs-based optical bio-sensing methods

5 总结与展望

生命科学和纳米技术是当今科学研究的两大热门领域，随着生物技术和纳米材料的不断相互交叉渗透，生物传感方法的研究应用得到了极大的发展。AuNPs易于合成和表面修饰，具有独特的光电效应和良好的生物相容性，使其在光学生物传感方面得到广泛应用。本文围绕AuNPs独特的光学性质，分别介绍了基于AuNPs的比色生物传感法、荧光生物传感法、电化学发光生物传感法和光散射生物传感法的研究进展。基于AuNPs的光学生物传感方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强及检测速度快等优势，已被广泛应用于生物医学、药物分析、环境监测和食品安全等领域。

但是，基于AuNPs的光学生物传感方法还有待进一步提高，如检测体系的背景干扰、检测信号低，在复杂体系中的抗干扰能力不够理想及局限于体外分析等。此外，其检测结果的稳定性也有待提升，在构建通用型的生物传感系统方面仍存在很多挑战，还需将更多的纳米材料、信号放大技术和输出方式等引入到传感系统中以拓宽其使用范围。未来的生物传感技术将会朝着智能化、微型化、集成化与多功能一体化的方向发展。另外，实验室开发的新型生物传感方法转化为廉价高效、便携实用的产品，并逐步实现商品化和产业化将成为一种必然趋势。