液晶生物传感及其在微流控细胞分析中的应用

李玮玮，李雨轩，林金明

(清华大学 化学系，微量分析测试方法和仪器研制北京市重点实验室 生命有机磷化学和化学生物学教育部重点实验室,北京 100084)

液晶(Liquid crystal,LC)是一种性质介于固态和液态的物质态，既具备晶体固体的各向异性，也具备液体的流动性[1]。一种固体材料在完全转变为各向同性的液相之前，可能经过一个或多个以分子取向为特征的中间液晶相，相转变过程或受溶剂的影响，或受热过程的驱动，相应的材料则被称为溶致液晶和热致液晶[2-3]。溶致液晶是当两亲分子在有机或无机溶剂中的浓度达到一定范围时，通过自组装有序排列形成[4]。热致液晶由棒状或盘状的各向异性分子组成，相变过程受温度变化影响，仅在一定的温度范围内呈现液晶性质[5]。在20世纪60年代到70年代间，液晶科学得到迅速发展，期间液晶显示技术的发展在很大程度上也推动了基础和应用研究[6]。液晶显示器一般使用棒状热致液晶，LC分子在一定强度的外加电场作用下发生取向变化。也就是说，由各向异性分子组成的液晶与外加场相互作用，强烈地改变自身的排列结构。更令科学家感兴趣的是，除了物理场之外，LC对界面化学和生物物质的变化也极为敏感。因此，近年来基于液晶化学/生物传感器的研究取得了很大进展，拓宽了液晶材料的应用领域。液晶对界面的高灵敏响应和固有的光学各向异性(双折射特性)是液晶传感分析化学/生物物质的基础[7]。生化分析物的刺激或界面附近发生生化反应会影响LC分子间相互作用的力平衡，导致LC分子排列取向改变。在偏光显微镜(POM)下，LC分子的这种取向改变呈现出不同的偏光形貌。因此，液晶传感分析消除了对标记/标签的需求，可通过LC分子有效地放大生化信号的光学响应。目前，已经有许多综述介绍了液晶传感器在生物化学分析领域的应用[8-10]。本综述以近年来液晶生物传感器在检测生物小分子、生物大分子以及生物有机体(病毒、细菌、细胞)等方面的研究进展为线索展开介绍，特别提到了其与微流控细胞芯片结合的新兴领域的发展和挑战。

1 生物小分子分析

液晶生物传感器已经被广泛应用于生物小分子物质的检测分析，比如寡肽、磷脂、尿素、葡萄糖等。Bai等[11]研究了二肽有序单分子膜上向列相液晶的取向有序性：向列相液晶5CB(4-氰基-4′-戊基联苯)和TL205(含环己烷氟化联苯和氟化三苯的介晶混合物)在二肽有序单分子膜上的排列取向明显受二肽的手性和磷酸化状态的影响。上述属于一种液晶-固体界面型的液晶生物传感器，然而由于水对生物分子的结构和功能具有重要的保护作用，因此一些关于液晶和水相形成界面的研究为创建液晶-水界面型的生物传感器提供了新机会[12-13]。例如，Brake等[12,14]研究了引入磷脂的液晶-水界面上LC分子的排列取向变化，在纯液晶-水界面上，LC分子倾向于平行于表面排列，即沿面排列(Planar)，而磷脂的引入诱导LC分子的取向变为垂面排列(Homeotropic)；在含有酶负载液晶层的生物传感器上引入含脂质的水溶液可对酶促反应进行检测，酶促反应发生前，LC分子由于磷脂的诱导作用在界面上呈垂面排列，随着酶促反应进行，界面区域的脂质被耗尽，LC分子的取向变为平面排列，对应酶促反应进程，在POM下可观察液晶层呈现不同的偏光光学形貌。类似的这种平面薄膜型的液晶传感器(厚度通常为几微米)，通过功能化修饰还可实现对抗生素及其水解酶的高灵敏检测[15]。

液晶分散在水相溶液中形成的LC液滴也是液晶-水界面型传感器的一种重要形式，在液晶生物传感领域发展迅猛[16]。相比薄膜型液晶传感器，LC液滴无需通过表面处理的固体基板来确定LC分子的初始排列方向，其分子的初始取向结构由液滴界面的化学性质决定[17]。目标分析物吸附到LC液滴表面或在LC液滴附近发生反应，触发LC表面锚定的变化，从而使液滴内LC分子呈现不同的排列取向[18-19]。Park课题组[20-21]设计了一种聚(丙烯酸-b-4-氰基联苯-4′-十一烷基丙烯酸酯)(PAA-b-LCP)功能化的5CB液滴，并将脲酶或葡萄糖氧化酶共价固定在PAA链上，在POM下实现了对尿素和葡萄糖分子的高灵敏检测。除了将POM作为观测手段，Duan等[22]将硬脂酸掺杂5CB微液滴作为传感反应器和光学谐振腔，结合回音壁模式(Whispering gallery mode，WGM)激光技术，对生物小分子尿素进行了高灵敏检测(图1)：尿素和脲酶之间的酶促反应产生氢氧根离子，导致水/液晶界面的硬脂酸脱质子化和自组装，诱导了LC分子的排列取向变化；WGM激光光谱的可探测位移与LC分子的排列取向相关，指示酶促反应进程并实现了对尿素的定量检测。

图1 硬脂酸掺杂的5CB微液滴作为传感反应器和光学谐振腔，结合WGM激光技术用于尿素分子的检测[22]Fig.1 Stearic acid-doped 5CB microdroplet as both optical resonator and sensing reactor,combined with whispering gallery mode(WGM) lasing technology for detection of urea[22]

2 生物大分子分析

液晶生物传感器在检测分析蛋白质、核酸等生物大分子方面也有广泛的应用。基于薄膜型LC传感器，Hu等[23]设计了一种适配体靶向诱导解离辅助的功能性LC传感方法，可同时检测血液中多种肿瘤标志物(见图2)：适配体1(apt1)修饰的磁珠(MBs)特异性捕获血液中的靶蛋白，靶蛋白包被的MBs与信号DNA/apt2共同孵育后，由于apt2对靶蛋白的特异性识别，在MBs上形成apt1/靶蛋白/apt2三明治复合物，诱导信号DNA释放；信号DNA被负载互补DNA的LC传感器特异性识别，引起LC传感器偏光形貌的改变。类似地，他们还通过原位RCA反应放大肿瘤标志物信号，在原位RCA产物转移到十八烷基三甲基溴化铵(OTAB)修饰的LC界面后，液晶层的偏光形貌由暗变亮[24]。微流控技术在制备液滴型LC传感器方面展现出巨大优势，制备的LC微液滴可用于生物大分子的特异性识别检测。Khan等[25]通过液滴微流控的方法制备了PAA-b-LCP功能化的5CB液滴：与LCP嵌段紧密连接的PAA包覆在5CB液滴表面，通过共价偶联对其进行生物素化修饰，用于特异性检测水/LC界面上生物素(Biotin)—亲和素(Avidin)的特异性反应：生物素和亲和素在液滴表面特异性识别结合后，引起液滴表面电荷密度的改变，导致5CB液滴在POM下呈现从辐射(Radial，R)到双极(Bipolar，B)的织构转变，表明了功能化的LC液滴可通过配体-受体模型特定性地检测蛋白质或其他分析物。

3 生物有机体分析

LC液晶传感器在检测细菌、病毒和细胞等有机体方面展现出了巨大的潜能。单分散的5CB液晶液滴可用于区分不同类型的细菌和病毒，接触革兰氏阴性(G-)细菌和脂膜病毒发生从B到R的织构转变，而对G+细菌和非脂膜病毒则不会发生织构转变[26]。上述织构转变被归因于脂质从生物体向LC液滴的转移。LC传感器在细胞层面的应用将有助于对细胞生命活动的探索，推动细胞生物学的发展。Yoon等[27]将与叶酸(FA)配体共轭的聚(苯乙烯-b-丙烯酸)嵌段共聚物(PS-b-PAA)修饰至5CB液晶液滴表面，LC液滴上的叶酸配体与人口腔表皮样癌细胞(KB)的叶酸受体发生特异性相互作用，导致LC液滴发生R-B的织构转变，实现了对KB细胞的特异性识别(图3)。该研究小组[28]进一步设计了β-半乳糖与PS-b-PAA共轭修饰的5CB液晶液滴，对肝癌细胞(HepG2)的识别表现出了高度选择性，HepG2细胞与β-半乳糖共轭的嵌段共聚物发生相互作用，有效地引起LC液滴发生R-B的织构转变，他们认为嵌段共聚物的聚苯乙烯段将配体-受体的相互作用力从界面传递到LC液滴的内部。但是以上用于细胞识别的LC液滴的尺寸与细胞的尺寸相当，在检测灵敏度上有待提高；另外，为了维持LC液滴在水相介质中的形貌，需加入表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)，但SDS对细胞的毒害作用可能影响细胞活性。为了获得更加灵敏的响应和更好的生物相容性，Manna等[29]将液晶E7(一种向列相液晶混合物，向列相的温度范围TN=10～60 ℃)封装在共价交联的聚合物微胶囊中，实时检测细胞周围介质中是否存在对细胞有害的物质，但未追踪细胞释放的分子或离子的动态变化。

图3 叶酸配体修饰的LC液滴体外检测人口腔表皮样癌细胞[27]Fig.3 Folate ligand anchored liquid crystal microdroplets emulsion for in vitro detection of KB cancer cells[27]

4 微流控芯片细胞分析中的应用

微流控芯片由于小型化、集成化等优点，容易实现与液晶传感器的结合，在细胞分析领域具有广阔的应用前景。将液晶生物传感器引入微流控细胞芯片是细胞分析前沿的一个崭新领域。本课题组在与微流控细胞芯片结合的液晶生物传感方面进行了开发和研究：如通过设计一种具有良好生物相容性的聚合物封装的液晶微滴(P-E7PBA)，可固定在微流控芯片上培养的细胞表面高灵敏度、高选择性地实时监测细胞/单细胞释放的NH3[30]：通过将掺杂4-戊基联苯-4′-羧酸(PBA)的液晶E7封装在聚电解质层层自组装的微胶囊中制备P-E7PBA；由于P-E7PBA聚合物层外表面的氨基有利于其固定在负电荷的细胞膜表面，固定在细胞膜上的P-E7PBA响应细胞释放的NH3，并引起自身表面电荷密度的改变，诱导了LC分子的排列取向变化，POM下可观察到P-E7PBA从R到B的织构转变。考虑到P-E7PBA聚电解质层层自组装的制备耗时，我们进一步设计了可直接固定在微流控芯片上培养的细胞表面的辣根过氧化物酶修饰的液晶弹性体微球(LCEM-HRP)，以超高分辨率、选择性监测细胞释放的H2O2(图4)[31]：LCEM-HRP通过一种同心(Concentric，C)向辐射(Radial，R)的织构转变(C-R)可视化实时报告细胞产生的H2O2，这是由于HRP催化还原H2O2引起了微球的去质子化和内部链间/链内氢键断裂；细胞表面的LCEM-HRP发生C-R织构转变的水平反映了细胞H2O2释放量的差异，由此可探索细胞系和细胞-细胞的异质性。

图4 一种辣根过氧化物酶修饰的液晶弹性体微球(LCEM-HRP)可直接固定在2D微流控芯片上培养的细胞表面监测细胞释放的H2O2[31]Fig.4 Elastomer microspheres functionalized with horse-radish peroxidase(LCEM-HRP) can be immobilized directly on the surface of cells cultured on a 2D microfluidic chip to minitor the releasing of H2O2 from cells[31](A) LCEM-HRP immobilized directly on cell membrane to visualize the real-time releasing of H2O2 from a single-living cell;(B) LCEM-HRP responds to the releasing of H2O2 from cells,and changes the orientation of LC molecules;(C) With a POM,LCEM-HRP shows a concentric to radial transfiguration((A) LCEM-HRP直接固定在细胞膜上用于监测单个细胞释放H2O2；(B) LCEM-HRP响应细胞释放的H2O2，液晶分子的取向发生改变；(C) 在POM下，LCEM-HRP呈现从同心到辐射的织构改变图像)

上述P-E7PBA和LCEM-HRP引入的均为2D微流控细胞芯片，随芯片内微流体的层流流动，可直接固定在细胞表面对细胞释放的分子进行特异性的实时监测，依托于微流控芯片的优势，该方法显著减少了样品试剂的用量和体积。微流控细胞芯片除了支持细胞培养，还可为体外细胞模拟/重构体内细胞微环境[32-33]。在模拟细胞微环境下，如机械应力刺激、生化因子浓度梯度分布以及细胞-细胞相互作用等，通过集成的液晶生物传感器实现对细胞及其微环境变化的监测，对细胞分析和细胞生物学的发展具有重大意义。

然而，目前将液晶生物传感器引入微流控细胞分析还是一个崭新的领域，面临着许多问题与挑战。首先，微流控芯片允许进行2D/3D细胞培养以及细胞微环境模拟，然而不同培养维度下细胞微环境在空间组织结构、物质传输方式、浓度梯度分布等方面存在差异性，要求设计适合不同细胞培养维度的液晶微传感器以获取真实的细胞生命活动信息。在2D静态细胞培养条件下，检测以细胞作为唯一来源或者消耗的物质浓度，与距离细胞的位置有直接关系，为了获取接近细胞真实释放或者消耗水平的定量检测，有必要在细胞附近甚至是细胞表面引入一个位置明确的传感器。能够固定在细胞表面的液晶生物传感器要求尺寸应在几微米，且具有良好的生物相容性和长时间的机械稳定性，甚至可以在细胞表面以可控数量和明确位置进行精确固定，这需要进一步研究方可实现。而3D细胞培养具有更加复杂的化学性和空间性，对引入其中的液晶生物传感器在满足2D细胞培养条件的基础上提出了更高要求。例如，向一种广泛使用的3D细胞培养模型——多细胞微球中引入液晶生物传感器以检测细胞代谢物质，而对于引入传感器的位置和几何形状设计，以及代谢物质向传感器的运输方式等问题尚需进行更深入的研究。此外，细胞界面现象的多样性和复杂性，以及目标生化分析物呈现的化学官能团的多样性和复杂性，不但增加了传感设计的难度，也使得预测LC分子在含目标分析物的界面上的排列取向成为一个亟待解决的特殊挑战。

5 结 论

液晶传感器具有的许多独特优势，如对界面物理化学性质响应敏感，容易通过化学修饰实现对目标分子的特异性识别，无需对目标生物分子进行标记，界面液晶分子的取向变化传至液晶本体快速放大信号响应，以及可实现小型化和生物相容性设计等，使其在生物传感分析方面展现出了非凡的应用价值。本文针对近年来液晶生物传感器在检测分析生物大/小分子和生物有机体等方面的研究进展做了简要综述。此外，还特别介绍了新兴领域——液晶生物传感器引入微流控芯片细胞分析当前的发展与面临的挑战。总之，目前液晶生物传感器已发展到检测分析细胞等生物有机体，然而就液晶传感器的尺寸、稳定性、特异性、生物相容性、传感设计原理以及对不同细胞培养模型的适用性等诸多问题还值得进行更加深入的设计与研究。