凝胶渗透色谱柱填料研究现状

房志鹏，于 冰*，丛海林，刘虎威

(1.青岛大学 化学化工学院，材料科学与工程学院，生物医用材料与工程研究院，山东 青岛 266071；2.武昌理工学院 生命科学学院，湖北 武汉 430223)

凝胶渗透色谱法(GPC)是19世纪60年代开发的一种液相色谱分离技术。其分离基础是溶液中溶质分子的大小，溶质分子的洗脱量(即保留在色谱柱中的量)主要取决于物理参数，如溶质分子尺寸，不同填料的孔径、孔隙率存在的差异，色谱柱体积以及流动相和固定相之间相互作用的差异，而与样品无关。因此，凝胶渗透色谱具有对流动相的要求低、实验条件相对稳定、重现性高、分析速度快、溶质回收率高等优点，使得该方法与其他方法相比具有更独特的分离效果。由于其根据溶质分子的大小进行分离，已得到迅速发展并在许多领域获得广泛的应用。GPC法作为一种工具，在聚合物分子量测定以及分子量分布的精确测定方面具有广阔且更有前途的应用前景。随着液相色谱技术的发展，尤其是各种微孔高效凝胶填料的出现，GPC法越来越多地应用于石油、药物、生物以及食品等领域，多用于物质组成分析以及对组分进行结构特性分析等。近年来，作为一种样品预处理技术，GPC也被广泛用于生物、环境、医学、食品等样品的预处理、分离和纯化[1-3]。

柱填料是GPC技术的核心关键，其应用广泛且对分离纯化的结果起着决定作用。目前，基于凝胶的柱填料使用最为广泛，例如聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖凝胶、聚苯乙烯凝胶、琼脂糖凝胶等。本文以上述填料为主，对凝胶渗透色谱柱填料的合成、性能和应用进行介绍。表1列出了此4种填料的主要制备方法及应用。

表1 常用填料的制备方法及其应用Table 1 Preparation and application of common fillers

1 聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺(PAM)凝胶是一种合成凝胶，由丙烯酰胺(AM)单体构成，并以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂进行交联反应。将其处理后形成颗粒。各种不同类型凝胶的制备可通过控制交联剂占反应体系的比例来实现，交联剂越多，孔越小。其适用于蛋白质[4-5]和多糖的纯化。

聚丙烯酰胺微球又称聚丙烯酰胺微粒或聚丙烯酰胺微凝胶，是指丙烯酰胺单体的均聚物或与其他单体共聚形成的高分子微球[6]。作为一种功能微球材料，其具有良好的吸水及保水性能，此外还具有良好的生物相容性，在众多领域有着广泛的应用。目前，聚丙烯酰胺微球的主要制备方法为均相法和非均相法。常见的均相法有反相乳液聚合法和反相微乳液聚合法，产物大多呈胶乳或微胶乳形态；非均相法有分散聚合法、沉淀聚合法、反相悬浮聚合法等，产物一般呈固体微粒状态。

Yao等[7]采用聚合诱导相分离法，制备得到多孔磁性聚丙烯酰胺微球，微球表面由于具有多孔结构和磁性，对亚甲基蓝(MB)具有较高的吸附效率。此外,微球对单独存在的中性红和龙胆紫或两者混合溶液也具有很高的吸附能力。该微球最少可重复使用6个循环，与目前已有的吸附剂相比，具有更好的吸附能力和更高的效率，在阳离子染料吸附分离领域具有广泛的应用前景。Zou等[8]通过丙烯酰胺和海藻酸钠的乳液聚合，制备了一种新型双网络结构的聚丙烯酰胺/海藻酸钠复合微球吸附剂，实现了对阳离子染料MB的吸附。该复合微球包含大量均匀分布的中孔，孔径分布为0～200 nm。引入海藻酸钠(SA)后，PAM的热稳定性和结晶度虽略有下降，但MB的吸附容量显著增加。

Wang等[9]合成了一种具有良好自发荧光的新型聚丙烯酰胺微球(fPAMMP)。通过原位聚合制备不同尺寸的低产率fPAMMP，利用反相微乳液聚合反应合成了小尺寸的高产率fPAMMP。制备的fPAMMP具有可见荧光(VF)和近红外荧光(NIRF)的强而稳定的自发荧光，在各种严格条件下(如碱、酸和高温)也具有很高的稳定性。所制备的fPAMMP具有高正电荷，可用于有效捕获链霉亲和素和DNA等各种生物分子，在聚合酶链反应(PCR)检测中有良好的应用前景。

2 交联葡聚糖凝胶

作为多糖大家族中的一员，葡聚糖(右旋糖酐)存在于某些微生物生长发育过程中排泄的黏液中，分子量较高，在输血过程中可代替部分全血(称为代血浆)，在临床上的应用已有悠久历史。软性凝胶家族庞大且多样，其中具有多孔性三度空间网状结构的交联葡聚糖凝胶微球具有丰富的孔道，能吸入大量的溶剂。凝胶体积可在水中溶胀数倍且不会溶解。孔径范围不同，其分离范围也不同，在生物化学中被大量用于蛋白质[10-11]、核酸、酶和多糖类高分子物质的分离,是分离纯化生物大分子不可或缺的一类介质[12]。

交联葡聚糖凝胶微球的制备过程并不复杂，首先选取葡聚糖单体作为原料，后加入交联剂与单体发生交联反应，再经后处理得到微球。葡聚糖具有奇特的胶凝特性，单体通过交联反应后得到的交联葡聚糖凝胶微球不但具备优良的亲水性，还具备良好的水不溶性以及吸水后溶胀的特点，在生物医药领域具有广泛的利用价值。另外作为层析凝胶介质，其在分离纯化方面也有着悠久的使用历史，在其他领域也将有广泛的应用前景。就现阶段而言，交联葡聚糖凝胶微球的制备方法分为化学、物理和相分离法，其中通过化学法生产的微球仍占市场主流。

交联葡聚糖凝胶微球常用的化学制备法是乳化交联法和反相乳液聚合法。这两种方法是预先将葡聚糖单体溶于氢氧化钠溶液中构成水相后，加入含有交联剂的有机相中，经搅拌使两相充分乳化，向溶液中加入交联剂以形成微球。物理法是将药物通过设备作用使其在气相中进行微囊化的方法[13]。相分离法是通过改变混合溶液的溶解条件来降低聚合物在溶液中的溶解度，进而使微球从溶液中沉淀[14]。

交联葡聚糖凝胶微球作为一种具有较好生物相容性的药物载体材料，不仅可提高药物的稳定性，对药物起到缓释作用[15-17]，还可作为环境敏感型分子的保护载体[18-19]和显影剂使用[20]，未来有望用作伤口辅料[21]。本文着重介绍其在医药、凝胶层析、色谱分离、固相吸附及分析等领域的应用[22]。

曾家豫等[23]利用型号分别为G-25、G-50、G-75、G-100、G-125的Sephadex层析柱，对纤维素酶粗酶液进行分离。结果表明G-75具有良好的分离效果，其回收率可提高至41.6%，且与分离前相比，酶的比活力可提高4.9倍。张慧丽等[24]用Sephadex LH-20层析法对人参粗品进行两次分离纯化，再用Sephadex LH-20柱进一步纯化得到人参皂苷Re，回收率为58.6%，纯度为96.2%。该法简化了样品处理过程，克服了层析柱中原介质无法反复利用及再生繁琐的弊端，具有省时、省力的优点[25]。包建民等[26]采用反向悬浮聚合制备的交联葡聚糖凝胶微球具有优良的球形度、分散性、吸水溶胀和凝胶过滤分离性能，被用于对脂质体与药物进行分析检测。

由于交联葡聚糖凝胶微球具有良好的生物相容性和可降解性，因此常被应用于靶向应用、栓塞治疗、缓控释应用等[27]。在控释方面，药物可包裹在葡聚糖内形成微小的球状物，既能达成靶向的目标，也能达成缓释的目标。Tomme等[28]将带相反电荷的交联葡聚糖凝胶微球混合分散，制得的凝胶主要应用于药物活性蛋白基体，适用于传递药物以及组织工程等领域。

3 聚苯乙烯凝胶

聚苯乙烯是以苯乙烯单体作为反应原料，选取不同的交联剂通过一系列复杂的聚合反应得到的聚合物。苯乙烯单体分子具有一定的毒性，但聚合反应后得到的大分子聚苯乙烯无毒。相较于其它大分子，聚苯乙烯获取方式及成本更低，机械性能更出色，具备良好的化学稳定性以及更好的生物相容性[29]，在吸附领域得到了非常广泛的应用[30-32]。与其他凝胶相比，聚苯乙烯凝胶的网状结构更大，因此用于分离分子量分布在1.6 k～40 000 k的生物大分子。聚苯乙烯还具有优良的机械强度，在手性药物[33]、有机聚合物、抗肿瘤药物[34-35]和油溶性天然物质的分离领域有着广泛的应用。

聚苯乙烯呈中性，交联聚苯乙烯-二乙烯基苯微球具有多孔结构，多被用于亲脂性聚合物分子量的测量以及使用有机洗脱溶质进行分子量测量[36]。另外可用于分离结构相似的分子。

超交联聚苯乙烯的交联度和机械强度极高，与其他填料相比具有更高的耐压性以及耐化学性，作为填料使用时可承受色谱柱中的高压降。它可以使用任何pH值的水性洗脱液，这对硅胶填料来说是不可能实现的。因此，超交联聚苯乙烯可用于反相、分配、尺寸排阻色谱等。虽然聚合物表面上没有可测量的极性和带电基团，然而其能够对离子混合物进行有效分离。

孙磊丽等[37]以呈中性的多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)微球为填料，填充于S-X3玻璃柱作为GPC净化柱，建立了一种检测甘草中16种农残的方法。沈习习等[38]选用苯乙烯树脂为填料填充SX-3柱作为净化柱，建立了一种检测北京烤鸭鸭皮中16种多环芳烃的方法。Xu等[36]通过改性的种子聚合法合成聚苯乙烯多孔微球，发现合成的微球在碘萃取上具有良好性能。袁媛[39]以苯乙烯为单体，过硫酸钾为引发剂，二乙烯基苯为交联剂，采用可逆加成-断裂链转移(RAFT)活性聚合的无皂乳液聚合法制备了单分散的聚苯乙烯交联微球。顾玥等[40]采用悬浮聚合法和超交联两步法制备了一种介孔改性聚苯乙烯微球，此微球在血液净化领域具有良好的应用。Cong等[41]通过改进后的两步种子溶胀法制备出粒径约为10 μm的单分散交联聚苯乙烯微球，发现改性后的微球对有机酸以及手性药物有良好的分离效果。

聚苯乙烯微球(PST)具有理想的机械强度、可调节的粒径和良好的化学稳定性，被普遍用作固定化载体。但使用微球进行固定的报道很少，Li等[42]制备了具有大孔和巨孔的PST,研究了孔径对脂肪酶分布、相对活性、动力学行为、热稳定性、储存稳定性和可重复使用性的影响。根据激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)(如图1)和扫描电镜(SEM)，发现脂肪酶渗透到巨孔和大孔微球的中心，而介孔微球只在表面发生吸附现象。另外，固定化脂肪酶的比活性与巨孔/大孔/中孔PST的孔径密切相关。在100次循环结束后仍具有很高的稳定性，且微球固化酶表现出较高的活性。因此，与其他微球相比，大孔PST作为工业上潜在的酶载体显示出明显优势。

图1 巨孔(A)、大孔(B)和中孔(C)PST微球固定化荧光胺脂肪酶的LSCM图[42]Fig.1 LSCM images of fluorescamine-lipase immobilized on gigaporous(A),macroporous(B) and mesoporous(C) PST microspheres[42]scale bars represent 10 μm in each case; corresponding fluorescence distribution profiles along diameter are displayed below

4 琼脂糖凝胶

琼脂糖(Agarose)作为一种天然高分子材料，在生物相容性方面表现出色。琼脂糖凝胶是以琼脂糖单体作为原料制备得到。琼脂糖分为普通琼脂糖和化学修饰的低熔点琼脂糖。因琼脂糖具备较大的孔径，琼脂糖凝胶常被用于大分子蛋白质[43]和DNA等物质的分离。琼脂糖凝胶微球是呈多孔、亲水和电中性的一种常用多糖微球，其多糖链具有几个羟基可被活化并偶联不同基团[44]。琼脂糖微球的传统制备方法主要有喷射法[45]、悬浮搅拌法[46]、微流控制法[47]和膜乳化法[48]等。

纤维素基吸附剂因生产成本低、易改性和生物相容性而受到越来越多的关注。然而，纤维素的固有缺陷，如弱机械性能和高结晶度等会严重影响分离效率。为克服这些问题，Zhao等[49]提出了一种预交联结合琼脂糖杂交的方法(如图2)构建高强度、低结晶度的纤维素基微球。纤维素/琼脂糖复合微球具有优异的机械稳定性，在蛋白质分离方面具有巨大潜力。为研究其在蛋白质分离中的应用潜力，用2-二乙基胺盐酸盐对预交联纤维素/琼脂糖复合微球(PRCA)、后交联纤维素/琼脂糖复合微球(POCA)进行了改性，并对其吸附容量、吸附速率和可回收性进行评价。

图2 PRCA和POCA的制备[49]Fig.2 Preparation of PRCA and POCA[49]A：the crosslinking agent(epichlorohydrin) is preliminarily mixed with cellulose and agarose aqueous solution(pre-crosslinking),while the epichlorohydrin is added after emulsification in post-crosslinking process;B：the mechanism of cellulose and agarose chains crosslinked by ECH；C：the cellulose and agarose chains in PRCA are evenly crosslinked by covalent bonds while the internal cellulose and agarose chains of POCA is mainly crosslinked by hydrogen bonds

Zhao等[50]提出了一种改进的膜乳化技术用于制备大粒径琼脂糖微球，其粒径约为90 μm，且粒径分布窄。通过增加水分散相中琼脂糖的浓度，可制备均匀性在2%～10%(质量分数)范围内的微球。该研究中使用的膜乳化装置放大后，可为制备工业应用的均匀尺寸琼脂糖色谱填料提供一种有效的新工具。

琼脂糖凝胶微球在很多领域均有广泛应用，其中在分离分析领域应用尤为突出。邱广亮等[51]选用琼脂糖等天然高分子材料在磁性氧化铁粒子表面进行包覆，制备得到磁性琼脂糖微球。发现该磁性微球兼具两种材料的优点，磁性使其能够进行分离和磁性导向，此外还有良好的生物相容性、表面具备大量官能团、良好的分散性，具有极为广阔的发展利用用途。尹霜霜等[52]采用反向悬浮再生法制备磁性琼脂糖微球，经交联活化后进行溴代醇化及其配基的偶联，用于分离牛血清蛋白，在合适pH值下最大吸附容量为79 mg/g，循环使用5次后吸附容量降至最大吸附容量的76%，证明多次使用后仍具有较好的吸附性能。刘微等[53]利用反相悬浮原理制备琼脂糖凝胶微球并进行交联，以此为基质经过羧基化反应制得羧甲基琼脂糖微球，发现以此微球作为填料在国产碱性蛋白酶的分离纯化、除色、除味等方面有着较好的效果，可达到国外同类产品效果。刘姗等[54]建立了一种使用琼脂糖微球抗体对原代乳鼠肺微血管内皮细胞进行筛选的新方法。

5 其 他

与常用的固定相相比，氧化锆在化学稳定性和机械强度方面的性能更为出色，因此吸引了很多研究者的关注[55]。氧化锆的pH值稳定性和对碱性物质优越的分离效果使其在生物化学、制药产业等领域具有广泛的应用前景，可用于氨基酸和多肽等生物分子。在蛋白质[56-57]、核酸、单克隆抗体分离[58-59]，对烷基取代的苯、芳烃、多环芳烃的分离也有报道[60]。氧化锆还展示了各种极端条件下其在分离方面的独特潜力[61-62]。若要实现高效率的分离，制备粒径均匀且分布窄的氧化锆微球最为关键。目前氧化锆微球的制备方法比较单一，主要有聚合-诱导胶体凝聚法(PICA)和油乳化法(OEM)。相较于前者，后者操作更简单，但后者制得的氧化锆微球单分散性差且孔径更小。目前我国多采用第一种方法制备氧化锆微球。在国外，有许多关于通过PICA法制备氧化锆微球的报道和专利。但国内关于制备条件对微球结构、粒径和粒径分布影响的报道相对较少。

作为一种硅胶填料，无孔硅胶的粒径小于2 μm(亚2 μm)，合成方法主要有Stber微球法[63-64]、Unger法[65-66]、Barder法[67]、水热法[68]、速率法[69]等。作为一种新型色谱柱填料，无孔硅胶具有很多良好的性质：其表面无孔且单分散性较好；具有较高的机械强度。相较于无孔硅胶填料，多孔硅胶的孔径分布在30 nm左右，且受传递介质阻力的影响，多孔硅胶在有机分析中存在很大的局限性，有机物的最大分子质量不能超100 kDa。研究发现，制备更小粒径的无孔硅胶填料有利于缩短分析时间、提高柱效，克服大粒径多孔硅胶在传质中存在的缺点，故近年来的研究热点集中于小粒径无孔硅胶上。

6 结 论

凝胶渗透色谱法作为色谱分离技术的一种，已广泛应用于生命科学、环境科学、材料科学、医药卫生、化学化工等学科研究和工业生产中。伴随着这些领域的强劲需求与发展，新的挑战不断出现。作为色谱技术的核心，色谱柱填料不仅是建立色谱方法的基础，也是消耗品。近年来，色谱填料呈现两大趋势：一是亚2 μm小孔硅胶、核壳型硅胶填料；二是具有丰富选择性的色谱填料，如手性色谱填料、亲水作用色谱填料和混合模式色谱填料等。与上述常见填料相比，有机高分子基质色谱填料领域近年来也十分活跃，其主要可分为多糖型基质填料和聚合物型基质填料。与传统填料相比，此填料具有更高的负载量和化学稳定性等优点，使其在生物大分子的分离分析领域应用极为广泛，但现阶段国内对此类填料的研究相对落后，还有很长的路需要探索。