常压电离质谱在脂质精确结构解析中的研究进展

李佳洁，王 超，邓洁薇*，栾天罡,2

(1.广东工业大学 生物医药学院，广东 广州 510006；2.中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275)

脂质是生物体的重要活性化学物质，在细胞膜组成、能量储存和信号传递等生物功能中发挥着重要作用[1-2]。2003年，美国国立卫生研究院所资助的“脂质代谢途径研究计划”项目提出了新的脂质分类系统，将脂质分为脂肪酰类(FA)、甘油脂类(GL)、甘油磷脂类(GP)、鞘脂类(SP)、固醇脂类(ST)、孕烯醇酮脂类(PR)、糖脂类(SL)和多聚酮类(PK) 8个大类[1]。每个脂质类别中又含有多种亚类，由于极性头基、酰基链的长度或不饱和键数量及位置、立体构型等的多样化，形成了成百上千种脂质及其异构体。截至2021年3月17日，除了区域异构体、氧化脂类和其他修饰形式外，脂质代谢途径研究计划(LIPID MAPS)结构数据库已包含超过45 568种独特的脂质结构。众多研究表明，脂类化合物的结构和功能与细胞生理过程、糖尿病、动脉粥样硬化、神经退行性疾病、肿瘤等疾病进程相关[3-5]。细胞的生理活性和生化功能高度依赖于脂类化合物的化学复杂性和结构多样性。因此，开展生物体的脂质分析和组学研究，对深入了解与脂质组成相关的生物学功能以及脂质在生命过程中的作用具有重要意义。

质谱(MS)技术由于灵敏度高、响应速度快、特异性好、无需标记、并且能给出丰富的分子结构信息等优点，正迅速地成为脂质分析和脂质组学研究的强有力工具[6-7]，且有关质谱技术在脂质组学研究方面的综述文章已经有不少报道[2,8]。近年来，常压电离质谱技术的发展，为常压条件下的原位、实时、直接、快速、生物脂质分析和组学研究提供了重要手段[9]。例如，美国普渡大学Cooks课题组[10]利用解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)技术分析了人脑肿瘤样本的小分子代谢物和脂质化合物；美国乔治·华盛顿大学Vertes课题组[11]利用激光烧蚀电喷雾离子化质谱(LAESI-MS)技术研究了磷脂酰乙醇胺(PEs)和磷脂酰甘油(PGs)在大肠杆菌和枯草杆菌中的分布，以及它们与抗生素的相互作用。在国内，广东工业大学栾天罡课题组[6]建立了基于表面修饰探针敞开式纳升电喷雾质谱技术的脂质组学方法，实现了Daphnia属生物大型溞和蚤状溞的快速鉴别；中央民族大学再帕尔·阿不力孜课题组[12]提出了基于空气动力辅助解吸电喷雾质谱(AFADESI-MS)的肿瘤代谢表征策略，通过对脂肪酸(FAs)、磷脂酰胆碱(PCs)、PEs等多种脂质的成像，深入探索了肿瘤代谢途径。

1 PB光化学反应与常压电离质谱联用

PB反应因与质谱溶剂兼容性好、操作简便、易于实现等优点，已成功地与多种常压电离质谱如纳升电喷雾质谱、液滴微连接表面采样探针质谱、表面修饰探针纳升电喷雾质谱等技术联用。以下将详细介绍PB光化学反应与常压电离质谱联用的分析方法。

1.1 PB反应与纳升电喷雾质谱联用

图1 PB反应与质谱技术联用[13]Fig.1 On-line coupling of PB reactions with MS for lipid analysis[13]A:experimental setup(实验装置图);B:PB reaction mass spectrum of oleic acid and acetone induced by UV irradiation of-nanoESI;insert:PB reaction spectrum using D6-acetone(以D6-丙酮为试剂的FA∶18∶1的PB反应质谱图),MS2 CID of the PB reaction products at m/z 339.3(C) and m/z 345.3(D)( 产物离子在m/z 339.3(C)和m/z 345.3(D)的二级质谱图),E:fragmentation scheme of PB reaction product isomers(PB反应产物离子的裂解方式)

甘油三酯(TAGs)是一类非常重要的脂质化合物，作为能量储存的形式存在于生物体中。TAGs的水溶性非常低，采用丙酮/水作为PB反应试剂时，其质谱分析往往难以获得理想结果。华南农业大学杜冰团队[24]采用二苯甲酮为PB反应试剂，将美藤果油(Sacha inchi oil)溶解于含有二苯甲酮的甲醇/氯仿(体积比9∶1)溶液中进行PB-nanoESI-MS分析，对美藤果油中的多不饱和甘油三酯(PUTAGs)进行了结构鉴定，并对13种C57-PUTAGs和23种C59-PUTAGs进行了鉴定。

Heiles团队[26]以苯乙酮(AP)作为PB反应试剂，将不饱和磷脂酰胆碱(PC)溶于苯乙酮(含1%甲酸)溶液，经254 nm紫外光照射80 s后进行nanoESI-MS分析，可在质谱图中观察到增加了120 Da的光衍生化产物离子，且二级质谱图中可见质量差为88 Da的诊断离子对，由此证实了苯乙酮作为PB反应试剂的可行性，且苯乙酮的反应产率达50%～80%。

1.2 PB反应与直接采样电离质谱联用

2018年，欧阳证团队[28]提出了一种简单方便的直接采样电离质谱分析方法，将PB反应、直接采样电离与小型质谱结合，在即时检测方面具有非常良好的前景。该方法使用不锈钢针对生物组织进行快速取样，然后将载样的不锈钢针插入预先装载有萃取脂质溶剂的玻璃纳升电喷雾针中。在脂质萃取过程中，以丙酮/水为反应试剂，采用紫外光照引发PB反应。通过在不锈钢针上施加高电压，诱导脂质溶液产生纳升电喷雾离子化，并采用小型质谱仪进行分析，实现了大鼠脑、肝、肾组织的快速脂质分析，以及大鼠正常和癌性乳腺组织中 FA(18∶1(Δ9)) 和 FA(18∶1(Δ11))的相对定量，并在小鼠癌证组织中观察到FA(18∶1(Δ9))/FA(18∶1(Δ11))比率的显著变化。

1.3 PB反应与液滴微连接表面采样探针质谱联用

1.4 PB反应与表面修饰探针纳升电喷雾质谱联用

图2 SCP-PB-nanoESI-MS分析方法示意图[31]Fig.2 Schematic diagram for development of a SCP-PB-nanoESI-MS method[31]

1.5 PB反应与多孔聚合物涂层转移富集直接质谱联用

2 环氧化与常压电离质谱联用

2.1 环氧化与低温等离子体探针质谱联用

2.2 环氧化与解吸电喷雾电离质谱联用

2.3 环氧化与纳升电喷雾质谱联用

2019年，Yan等[38]首次报道了一种新颖可调的按需电化学环氧化反应与纳升电喷雾质谱联用鉴定不饱和脂质双键的方法。他们发现在盐酸和乙腈/水溶剂体系中，通过调节外加高压可以控制不饱和脂质双键的环氧化。施加2.5 kV电压可以关闭脂质环氧化，而将电压降至1.8 kV又可以实现脂质环氧化，且在不同电压下还可按需生成单/多个环氧化合物。酸性条件下加入氯化物，可以在脂质双键上原位形成次氯酸盐并转化为相应的环氧化物，整个反应过程在几秒内即可完成。电环氧化产物随后可通过CID裂解产生诊断离子来鉴定双键位置。单样品的快速开/关电环氧化、低样品消耗、对含有多个双键的复杂脂质的适用性以及不需要额外仪器等优点使得该技术在高通量脂质分析方面极具潜力。

3 臭氧诱导解离与常压电离质谱联用

4 紫外光解离法与常压电离质谱联用

紫外光解离法(UVPD)是另外一种非传统的离子激发方法，主要利用光子激活和碎裂离子的能力。具有发色团的离子吸收了紫外光子能量后，从基态跃迁到电子激发态，进而在其激发态上发生键断裂，从而产生丰富的碎片诊断离子，可用于化合物的结构或序列的表征[40]。

图3 小鼠脑(A～D)、人脑(E～H)和甲状腺癌转移淋巴结组织切片(I～L)的H&E染色、m/z 798母离子成像图、UVPD双键诊断离子强度比成像图，以及脑灰质和白质/癌组织和正常组织的UVPD谱图[41]Fig.3 Optical images of the H&E stained,DESI-MS ion image of m/z 798,DESI-UVPD ratio image of the ratio of the summed intensities of the UVPD double-bond diagnostic ions,expanded region of UVPD mass spectra of the white and gray matter,and UVPD mass spectra of cancerous and normal parts of tissue from(A-D) mouse brain tissue section,(E-H) human brain tissue section,and(I-L) lymph node tissue section with thyroid cancer metastasis[41]

Heiles等[26]将PB-nanoESI-MS与UVPD相结合，提高了对双键解离的选择性，该UVPD也需对仪器改造引入紫外激光源和光路。实验采用266 nm光源对不饱和脂质离子照射，未引起脂质离子的光解离。而采用苯乙酮作为PB反应试剂，先进行PB反应，再对产物离子进行紫外照射，则可发生紫外光解离，且提高了2.2倍PB反应选择性。此外，还考察了各种脂质加合离子(Li、Na和K)的PB和PB-UVPD实验。结果显示，PB反应后加合离子抑制了氧杂环丁烷的CID碎裂，无法得到诊断离子碎片和双键的信息，但经PB-UVPD反应后，氧杂环丁烷可以紫外光裂解，得到双键特异性的离子片段，因此可以通过PB-UVPD来识别碱金属加合物的双键位置。

5 结论与展望