水环境中胞内外抗生素抗性基因分析的DNA提取方法及污染现状研究进展

王敏妍，李亚丽，邹世春，杨 颖

(中山大学 海洋科学学院，广东 广州 510275)

1 水体中的胞内及胞外抗生素抗性基因

抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)是使细菌产生抗生素耐药性的功能基因，可通过产生渗透壁垒、促进药物排出、修饰作用位点和产生破坏药物分子有效结构的酶等机制发挥作用[1]。微生物耐药性的出现被认为是微生物应对抗生素选择压力、争取更高生存机会的自然进化反应，而抗生素在医疗行为和农业生产中的广泛使用和滥用是环境中ARGs不断增多的主要驱动力。据统计，2013年中国抗生素的总使用量达到了162 000吨[2]。约50%的人畜用抗生素会以原药的形式随尿液排出[3]，增加了抗生素在自然环境中的含量，促进了ARGs的产生及扩散传播。

按照ARGs在水环境中的存在形态，即其是否存在于结构完整的细胞的内部或外部，可将ARGs分为胞内ARGs(Intracellular ARGs,iARGs)和胞外ARGs(Extracellular ARGs,eARGs)。不同存在形态的ARGs在环境持续性、迁移能力和传播方式上有所差异。由于细胞膜的保护，存在于细胞内部的iARGs抵抗核酸酶降解的能力较强，但iARGs更容易在水处理等过程中随细胞一同被去除[4]，因此其在水环境中的迁移能力有限。iARGs可以通过细胞间的接触结合或经由噬菌体感染的转导机制在不同微生物间进行传播[3]。eARGs主要来源于死细胞的裂解和活细胞的分泌，其可分为吸附型eARGs(Adsorbed eARGs,a-eARGs)和游离型eARGs(Free eARGs,f-eARGs)。a-eARGs可通过吸附在细胞表面避免核酸酶的攻击，所以更能抵御环境压力的干扰。而水处理对f-eARGs的去除效果十分有限[4]，因此f-eARGs拥有更强的迁移能力。eARGs可以通过转化被自然环境中的感受态细菌吸收[3]，其中a-eARGs比f-eARGs更容易与感受态细胞膜进行偶联，从而具有更高的转化几率[5]。

ARGs在水环境中的长期存在和传播导致致病菌耐药性的增长与扩散，现已成为公共健康安全的潜在威胁。因此，需加强对水环境中不同存在形态ARGs种类和含量的分析检测，以评估水环境中ARGs的污染水平及影响。从水样中提取出高质量的胞内DNA(Intracellular DNA,iDNA)及胞外DNA(Extracellular DNA,eDNA)是对水环境中ARGs污染进行深入分析的前提。本文介绍了目前水环境微生物iDNA和eDNA提取的常用方法，并分析了它们在ARGs研究中的应用状况；同时比较了不同水环境中iARGs和eARGs的污染水平，并探讨了它们在水环境中的传播与环境归趋。

2 水样中iDNA与eDNA的提取方法

2.1 乙醇沉淀法

乙醇沉淀法是常用的水环境微生物DNA提取方法。Ficetola等[6]将水样与无水乙醇和乙酸钠溶液(3 mol·L-1)以10∶22∶1的体积比混合并置于-20 ℃过夜保存后，以5 500 ×g离心35 min，收集沉淀并弃去上清液，再使用DNA纯化试剂盒对沉淀进行提纯。乙醇可以消除核酸的水化层，使带负电荷的磷酸基团暴露出来；而乙酸钠中的Na+能与带电基团结合，降低核苷酸链间的排斥作用，有利于沉淀的形成。由于环境水样中DNA含量较低而杂质较多，乙醇沉淀法通常只作为DNA的初步提取手段，后续还需通过DNA纯化试剂盒等处理去除杂质，获得纯度更高的DNA。

乙醇沉淀法常用于水样总DNA或iDNA提取，Eichmiller等[7]利用乙醇沉淀法提取了井水和湖水水样的总DNA，Foote等[8]利用乙醇沉淀法提取了海水水样中的总DNA，Lekunberri等[9]利用乙醇沉淀法提取了排污口河水水样的细菌质粒DNA，发现在污水水样和排污口附近淡水水样中提取的iDNA在纯度和质量上可满足ARGs分析要求[9]。

乙醇沉淀法也被应用于eDNA的提取，如Zhang等[10]利用乙醇沉淀法提取污水处理厂水样中的f-eARGs。但乙醇沉淀法提取的eDNA纯度有限，如Yuan等[4]从污水水样中提取出eDNA的A260/A280为2.1，表明样品存在RNA污染，且乙醇沉淀法的eDNA产率不高，远低于磁珠法。

乙醇沉淀法通常适用于水样体积较小的情况。如Ficetola等[6]和Eichmiller等[7]提取淡水水样中DNA时使用的水样体积为15 mL；Zhang等[10]提取污水处理厂水样中f-eDNA时使用的水样体积为330 mL；Yuan等[4]提取污水处理厂水样中eDNA使用的体积为200 mL。环境水样中eDNA的浓度通常较低，为了获取足够的DNA供后续分析，需使用更大体积的水样。但使用乙醇沉淀法对大体积水样进行处理，容易造成试剂的大量浪费。

综上，乙醇沉淀法试剂简单，操作便利，是常用的水样总DNA提取方法，适用于微生物含量较为丰富的污水处理厂水样或靠近排污口的环境水样的总DNA提取或iDNA提取。由于环境水体中的eDNA含量较低，该方法较难获得满足后续ARGs分析所需的DNA质量与纯度。因此，不建议使用乙醇沉淀法提取清洁水体微生物DNA或环境水样中的eDNA。

2.2 十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)

CTAB法也是较为经典的DNA提取方法。CTAB具有可从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性；而在高离子强度溶液中，CTAB能与蛋白质和多聚糖形成复合物。CTAB法基于CTAB结合蛋白质和多聚糖的特性，先通过有机溶剂抽提去除蛋白质和多糖等杂质，再利用乙醇或异丙醇沉淀分离核酸。

CTAB法最常用于植物DNA的提取，也有部分研究将其应用于水样中DNA的提取[11-13]。利用CTAB法提取水样中的iDNA时，需用含有CTAB的裂解液裂解细胞，依次用苯酚-氯仿-异戊醇(体积比25∶24∶1)混合液和氯仿-异戊醇(体积比24∶1)混合液抽提后，再用异丙醇或乙醇沉淀DNA[11]。苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液抽提，可去除蛋白和多糖等杂质。苯酚使蛋白质变性的能力最强，但室温下可溶于水，氯仿不溶于水而与苯酚互溶，因而可在二次抽提中用于去除残留的苯酚。Wang等[11]应用改良的CTAB法从湖水水样中提取iDNA，分析了洪湖ARGs的相对丰度。

利用CTAB提取水样中的eDNA时，先用CTAB和异丙醇初步去除蛋白质和多糖等杂质，依次用苯酚-氯仿-异戊醇(体积比25∶24∶1)混合液和氯仿-异戊醇(体积比24∶1)混合液抽提后，再用乙醇沉淀DNA[4]。CTAB法对水样中iDNA的提取效果较好；但对eDNA的提取在质量和产量上均不理想。在ARGs的分析研究上，CTAB法较适用于污水处理厂水样或靠近排污口的环境水样中微生物的总DNA及iDNA提取，不适用于处理体积较大水样以及eDNA的提取。

2.3 DNA提取试剂盒

DNA提取试剂盒是较为成熟的水样DNA提取方法。对比乙醇沉淀法与CTAB法，商业化的DNA提取试剂盒往往具有毒性小、操作简便的优点。DNA试剂盒的使用通常包括细胞裂解、DNA吸附、杂质去除及DNA洗脱等步骤，不同试剂盒的差异主要体现在细胞裂解方式的选择上。如QIAamp DNA Mini Kit、QIAamp DNA Stool Mini Kit与DNeasy Blood and Tissue Kit使用蛋白酶裂解细胞；Power Water Kit与Power Soil DNA Isolation Kit通过微珠机械碰撞和十二烷基硫酸钠(SDS)溶液共同作用裂解细胞；FastDNA SPIN Kit for Soil使用磁珠机械裂解细胞[14]。被释放至溶液中的DNA通常使用离心柱膜或硅胶基质吸附，经洗涤、纯化后，通过洗脱缓冲液洗脱并收集。

不同DNA提取试剂盒对不同类型环境水样DNA的提取效果具有差异性。Walden等[15]对比了4种DNA提取试剂盒对微生物iDNA的提取效果，认为QIAamp DNA Mini Kit和Power Soil DNA Isolation Kit更适于湖水和污水样品的iDNA提取。Eichmiller等[7]对比了6种DNA提取试剂盒对湖水和井水总DNA的提取效果，发现Power Soil DNA Isolation Kit在湖水和井水中均显示出较高的提取效率；FastDNA SPIN Kit、DNeasy Blood and Tissue Kit和QIAamp Stool Mini Kit在不同水源水样中的提取效果差异较大；而Power Water DNA Isolation Kit和FastDNA SPIN Kit for Soil对水样中微生物DNA的提取效率并不理想。Yang等[16]使用FastDNA SPIN Kit for Soil有效提取并检测了污水处理厂水样的总ARGs；而Yuan等[4]尝试使用该试剂盒提取污水处理厂水样中的eDNA时，并未获得满足ARGs分析需求的样品。

总体来说，需根据不同的水样类型和目标DNA选择适合的DNA提取试剂盒。但就目前的研究而言，DNA提取试剂盒对eARGs的提取效果较差，不能满足后续分析需求。

2.4 二氧化硅固相萃取

在针对DNA提取的固相萃取方法中，常使用二氧化硅颗粒作为萃取相载体。在高盐度溶液中，二氧化硅表面丰富的羟基能与DNA上的磷酸盐通过阳离子桥键反应结合[17]，且二氧化硅颗粒巨大的比表面积提供了大量的结合位点，更有利于DNA与萃取相的吸附。此外，二氧化硅颗粒表面易于改性，可通过引入不同的官能团提高载体表面对DNA的吸附能力，其中氨基修饰的二氧化硅颗粒对水样DNA的吸附效果最好[18]。但使用二氧化硅固相萃取法提取环境水样中iDNA前，需进行裂解细胞前处理，将iDNA从细胞中释放。萃取完成后，可根据二氧化硅颗粒表面改性情况选择Tris-HCl、PBS缓冲溶液或有机洗脱液将DNA洗脱并收集[19-20]。

二氧化硅颗粒可用于环境水样中eDNA的提取。Wang等[20]提出了一种利用新型核酸吸附颗粒(NAAPs)从大量水样中富集、提取eDNA的方法，NAAPs由含有Al(OH)3涂层的硅胶组成，主要利用静电吸附进行提取，eDNA回收率在95%以上。Hao等[14]使用NAAPs提取自来水中的eDNA，并通过聚合酶链式反应(PCR)检测出了其中eARGs的浓度。

二氧化硅固相萃取在水样DNA提取中的应用潜力巨大，其易于改性的特性为提取效果的提升提供了更多的可能。研究结果显示，该方法可从大量环境水样中有效提取eDNA，用于后续eARGs的分析检测[20]。二氧化硅固相萃取无有机溶剂污染，可应用于低DNA浓度水样，易于改性，提取效率高，在自然水体中ARGs的检测方面有较高的可用性和发展前景。

2.5 磁珠法

磁珠法是分散固相萃取的一种方法，将微米或纳米尺度的磁珠分散在溶液中，其巨大的比表面积有助于结合水样中游离的DNA。磁珠一般由最内层的聚苯乙烯核、中间的磁性物质和最外的涂覆层组成。磁性物质一般为Fe3O4或γ-Fe2O3，比较常用的涂覆层材料为二氧化硅和聚乙烯亚胺(PEI)[21-22]。磁珠可通过氢键、疏水或静电作用结合DNA[23]。如二氧化硅涂层上的羟基可与DNA上的磷酸盐骨架通过钠阳离子桥键反应结合[4]。而且，DNA的负电荷比水中蛋白质或腐殖质等杂质高，更易与磁珠二氧化硅涂层上的羟基结合。因此使用二氧化硅涂覆磁珠对水样中DNA进行提取更有利于杂质的去除，提高DNA的纯度[24]。此外，磁珠表面易于修饰，可以根据不同的提取需求进行羧基和氨基的改性[25-26]。羧基修饰磁珠通过阳离子桥键结合DNA，氨基修饰的磁珠则被认为主要通过静电作用吸附DNA[27-29]。除了改性外，还可通过羧基-氨基结合或生物素-亲和素结合连接引物，进行特异性的DNA提取[23]。研究认为，与羧基磁珠和羟基磁珠相比，氨基磁珠吸附水样中DNA的能力更强[26,30]。而利用磁珠的磁性可方便有效地将吸附了DNA的磁珠从水溶液中分离，进行后续的洗脱收集。

相对于以上提及的DNA提取方法，磁珠法具有十分显著的优点：一是以磁性颗粒作为吸附载体，对有机溶剂的使用需求较小，避免了有机试剂排放对环境造成的影响；二是微米和纳米尺度的磁珠拥有较大的比表面积，且能均匀地分散到溶液中，相比于其他的固相萃取方法具有更高的DNA吸附效率；三是通过外部磁力吸引可直接分离吸附DNA的磁珠，省去了离心、沉淀和过滤等耗时较长的步骤[23]，操作简单。但冷冻、干燥、离心和其他导致局部磁珠浓度过高的操作可能会造成磁珠团聚无法再分散，降低其DNA提取效率，导致提取失败。

磁珠法十分适用于水样中eDNA的提取。Sheng等[30]发现氨基化的磁性介孔二氧化硅纳米粒子对eDNA的吸附能力达210.22 μg·mg-1。对于污水样品中eDNA的提取，磁珠法的提取质量和产量均优于乙醇沉淀法、CTAB法和DNA提取试剂盒(FastDNA SPIN Kit for Soil)[4]。Wen等[23]还提出了一种利用引物进行特异性DNA吸附的磁珠法，其提取效率达80%。暂未见使用磁珠法提取eDNA研究环境水体中eARGs污染水平的报道。磁珠法在eDNA含量更低的自然水体的适用性有待于更多的研究。但磁珠法高提取效率和可改性的特性，显示了其在自然水体eDNA研究中的可观应用潜力。

综上所述，针对不同类型的环境水样中的目标DNA，需选择合适的DNA提取方法。乙醇沉淀法、CTAB法和DNA提取试剂盒较适用于环境水体中总DNA及iDNA的提取，而二氧化硅固相萃取和磁珠法对eDNA的提取效果较好。若水样中微生物含量较高，可以使用乙醇沉淀法或CTAB法对较小体积的水样进行处理，而DNA提取试剂盒的使用则需根据环境水样的特征进行选择。二氧化硅固相萃取和磁珠法更适用于处理大体积样品，可对微生物含量较低的水样进行eDNA提取。其中二氧化硅固相萃取和磁珠法在低核酸含量水样DNA的提取方面发展前景较大。

3 特征水体中iARGs与eARGs的检出情况与迁移传播

通过选用有效的DNA提取方法获得环境水样中的iDNA及eDNA后，可使用多种分析方法分析样品中iARGs及eARGs的污染水平及特征[31]。本文在此基础上对污水系统、淡水系统及海水系统中iARGs与eARGs的污染水平与迁移传播特征进行了评述。

3.1 污水系统

污水处理厂是含有大量抗生素、抗生素耐药菌(Antibiotic resistant bacteria,ARB)及ARGs的医疗、生活和生产废水的集中处理地，是自然水体中ARGs的重要污染源[32]。相关研究结果显示，城市污水处理厂中iARGs和eARGs的浓度范围分别为105～1011、107～109copies·L-1[4,33]。进水中的iARGs含量略高于eARGs，但出水中eARGs的含量明显高于iARGs[4]。

ARGs在污水处理厂中的迁移转化主要体现在ARGs形态和含量的转变。活性污泥中原生生物对ARB的捕食、紫外线消毒对ARB的灭活可促使iARGs转变为eARGs；eARGs对细胞的吸附和解吸造成了f-eARGs和a-eARGs的互相转化；核酸酶降解、水解和光解可小幅降低eARGs的含量[34]；沉降池能使iARGs和a-eARGs转移到污泥中。总体上，与iARGs相比，eARGs迁移到自然水体的能力更强。污水处理厂中ARGs的水平基因转移也十分活跃。污水中的ARGs含量远高于自然水体[4-5]，而活性污泥中丰富的生理活动、活跃的细胞以及污水与活性污泥的充分混合，使污水系统成为ARGs传播的重要场所。此外，污水系统中的Hg和Ag等重金属的存在也会通过抗重金属基因和ARGs的共选作用促进ARGs的水平基因转移[35]。因此，污水中的ARGs水平基因转移发生率远高于自然水体。

3.2 淡水系统

淡水系统是污水处理厂出水的主要接收场所和重要饮用水源，河流和湖泊中ARGs的存在情况与公共安全息息相关。我国河水普遍存在ARGs污染，且所检出的ARGs种类十分丰富[36-42]。河水中的iARGs和eARGs的丰度范围分别为101～104、101～103copies·L-1[5]。iARGs是河水中ARGs的主要形态，占总ARGs的38.7%～97.0%；f-eARGs含量最低，仅占0.03%～30.4%[5]。湖泊是淡水水体的重要组成部分，全球液态地表淡水的90%为湖水[43]。湖水的较长更新周期和丰富的营养物质使湖泊比河流更具ARGs积累潜力，其ARGs丰度约在10-6～10-2copies·16S rRNA copy-1范围内，其中磺胺类和四环素类ARGs是其主要类别(表1)。相比于河水，湖水环境与ARGs污染的相关研究较少。对eARGs的研究主要集中在湖泊沉积物，湖水中eARGs的研究暂未见报道。

表1 湖泊中的ARGs含量Table 1 Concentration of ARGs in lakes

ARGs在河流和湖泊中的迁移转化主要受稀释作用、长距离输送、生物降解、非生物降解和吸附等机制的影响[44]。稀释作用的大小取决于输入水体的水量和流速[45]。相比于稀释作用和各种ARGs损失机制，长距离输送对ARGs在河流中的迁移影响并不大，离排污口较远的下游和排污口上游的ARGs含量差别不大[46]。紫外线辐射和原生生物捕食等会降低iARGs的浓度。脱氧核糖核酸酶导致的生物降解是eARGs的主要降解模式，a-eARGs比f-eARGs更能抵御核酸酶的攻击[47]。Strickler等[48]研究发现，适温、中性pH值和适度UV-B照射更有利于eARGs在淡水环境中的降解。f-eARGs可能会吸附到细胞上转变为a-eARGs，而f-eARGs和细菌也可能吸附到颗粒物上，随着颗粒物的沉降进入沉积物中。淡水环境中的ARGs含量不高，故其水平基因转移的效率相对较低。但淡水系统中的常见污染物，如重金属、农药和纳米材料等可促进水平基因转移的发生。Wang等[49]研究发现，淡水系统中的Cu2+能通过对细菌产生细胞损伤效应促进质粒RP4的共轭转移，从而促进ARGs的水平基因转移。

3.3 海水系统

海洋环境是水体中ARGs的最终汇入地，受人类活动影响较大的河口和近岸海域中ARGs的污染引起了人们的广泛关注。研究发现，qnr基因是我国沿岸海域的主要ARGs类型，占全部检测ARGs的50%以上[55]；tet基因占总ARGs的30.4%～60.3%[55]，sul基因也有着较高的检出率[55-58]，而erm基因则不足总检出ARGs的7%[55]。但也有研究发现我国渤海莱州湾海水中qnr基因的检出率和浓度均较低，说明不同海域中的ARGs污染具有不同的组成特征。我国海域中总ARGs水平地区差异较大，范围在103～1011copies·L-1，但在黄海和烟台四十里湾均检出过1011copies·L-1的高丰度ARGs[55-59]。

稀释作用是ARGs在海水中迁移的主要机制，河口海域与远离大陆海域的海水中ARGs丰度近4个数量级的巨大差异证明了稀释作用的主导地位[59]。与河流和湖泊相同，输送作用对ARGs在海水中的迁移贡献较小。没有细胞保护的f-eARGs最易被核酸酶降解、光解以及水解等机制降解，在营养盐含量比较丰富的河口和近岸海域，f-eDNA的更新周期小于6.5 h[60]。ARGs在海水中的水平基因转移传播通过转化、转导和接合3种方式进行。海水中eARGs发生转化的频率约为10-8～10-10[61]。由于海水中eDNA的浓度[61]和分子量[62-63]随离岸距离和水深的增加而降低，故转化频率也随之降低。有研究认为，较高的盐度会抑制eDNA与细胞的结合，因此海水中eARGs的转化潜力可能低于淡水和河口环境[61]。海水中iARGs的转导频率为10-7～10-9[64]，而接合频率约为10-7[65]。海洋病毒中ARGs的含量为0.004%～0.22%，部分病毒可携带多种ARGs，其中印度洋的病毒显示出相对较高的ARGs丰度[66]。由噬菌体主导的转导是海水系统ARGs水平基因转移的主要机制之一。

4 总结与展望

获得高质量的DNA是分析研究水环境中iARGs及eARGs污染情况的前提条件。水环境中ARGs的含量较低但多样性高，因此需要开发更有效率或选择性更强的DNA提取方法，才能全面分析水环境中多种iARGs及eARGs的污染特征。目前提取水样中微生物iDNA的技术已经较为成熟，DNA提取试剂盒是最常用的提取方法，未来可根据不同的水样特征和目标DNA研发更具有针对性的DNA提取试剂盒；而乙醇沉淀法也可通过共沉淀机制等改良处理进一步提升DNA提取效率。现有方法对水样中eDNA的提取效率和提取质量有待进一步提升，今后的研究可以基于二氧化硅和磁珠等固相萃取方法，通过表面改性等手段，开发适用于低核酸含量水样或选择性更强的eDNA提取方法。

通常来说，受人类活动扰动越大的水环境的ARGs含量越高。除污水处理厂出水外，iARGs在各种水环境中均占主导地位。目前污水系统是亟待开展ARGs治理的场所，有必要进一步研究不同污水处理技术对ARGs水平和传播的影响，并开发有效降低污水ARGs水平的处理技术。现有研究表明自然水体中的总ARGs水平相对较低，但还需要更多关于其eARGs含量和传播效率的研究，从而更全面地评估ARGs的环境风险并加强对其在水环境中传播的控制。