含钆对比剂的环境污染现状、毒性及分析方法

刘洪涛，陈 曦，沈素云，蒋 超，冯顺卿，栾天罡*

(1.中山大学 测试中心，广东 广州 510275；2.中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275)

钆对比剂(GBCAs)是目前常用的核磁共振(MRI)对比剂，与其他金属离子相比，钆离子(Gd3+)由于最外层有7个未成对电子，电子的诱导作用强，弛豫时间长，所以具有良好的顺磁性而被广泛研究[1]。游离的Gd3+因与Ca2+具有相似尺寸，在生物体内会抑制Ca2+参与的生物过程(如与含钙的酶结合使酶失活，影响钙离子通道等)，从而产生剧毒[2]。因此，通常会将Gd3+与螯合剂螯合，如二乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(DOTA等)，形成稳定的化合物而作为GBCAs使用。1984年Carr首次研究钆喷酸葡甲胺(Gd-DTPA)对人脑肿瘤的强化作用[3]。1987年美国食品药品监督管理局(FDA)正式批准其作为磁共振造影剂。1988年首个商品化的GBCAs投入市场，其后，各种GBCAs纷纷进入临床应用。目前商用的GBCAs有9种，按化学结构可分为线型和环型，或离子型和非离子型(见表1)。环型结构能束缚Gd3+，给Gd3+提供更好的保护，因此其比线型结构稳定。离子型环状的螯合物由于无需多余的螯合，最难释放Gd3+，因此比非离子型环状的螯合物稳定。由于含钆造影剂的水溶性强，热力学性质稳定，在环境中不易分解或除去，大量使用含钆造影剂还会造成地表水的钆含量异常升高。而2000年首次报道一种新疾病——肾源性系统性纤维化疾病(NSF)[4]，2006年流行病学研究提出NSF可能与含钆造影剂的使用相关[5]，含钆对比剂的毒性及环境归趋引起了科学家的关注。

表1 9种商用含钆对比剂的信息Table 1 Informations of nine commercial gadolinium-based contrast agents

1 环境污染现状

GBCAs具有很高的亲水性，污水处理厂的传统工艺不能很好地将其去除而进入环境[6]。目前GBCAs的环境风险研究集中在水环境方面。1996年，Bau等[7]首次报道了环境水体中Gd含量异常，发现城市河水中Gd元素含量在稀土元素中的占比远高于自然占比，异常的Gd含量应来自人为输入。Kümmerer等[8]估算1999年德国约有超过1 000 kg的Gd排放到地表水中，约占当年全球医用Gd使用量的5%。 Cyris等[9]基于一定假设条件下，外推出德国到2013年，每年约12吨的Gd通过排污系统进入环境。目前，德国、捷克、法国、美国、日本、韩国、澳大利亚等国家已在地表水中发现Gd含量高于自然水平上百倍，异常Gd含量通常发生在医疗及工业发达的地区[10-24]。在德国的一个污水处理厂出水口，Gd的含量甚至高达mg/L级[9]。Kulaksiz[25]、Tepe[26]、Schmidt[27]等均报道德国柏林自来水中Gd含量从2009年到2012年显著升高(最高11.5倍)，提示由Gd引起的健康风险持续提高。近年来，农村地区也发现了人为输入Gd浓度的增高，这可能归因于接受核磁共振扫描的病人回乡后体内的GBCAs经排泄进入环境[23]。水环境中Gd的异常引起了科学家关注，源自GBCAs的钆可成为污水中外源性物质的合适指示剂[28]，因此成为新型环境潜在污染物[6，29]。Gd元素可引起生态毒性，研究发现，水生生物(木霉菌、大型蚤、青萍、水芹、鲤鱼等)可从水溶液中富集Gd元素[30-33]，富集倍数为3.2～86.4，少数报道发现水系沉积物中含有人为输入的Gd[34-38]。提示存在Gd通过食物链放大影响人类健康的可能。本课题组也在中国南方某城市污水厂入水样品中检出4种GBCAs(未发表结果)，提示我国大城市存在GBCAs污染的可能性。

目前,COVID-19疾病的全球传播导致GBCAs的使用暂时减少，这种由于经济生产和社会化的瘫痪将在环境中留下强烈信号[39]。除了关闭工厂和企业外，所有国家都在关注新型冠状病毒对卫生系统的影响，并在为这种前所未有的情况做准备，一些非必要的医疗检查(包括磁共振成像的使用)和手术被推迟，以便腾出足够的医疗能力和人员。目前，医疗机构进行的MRI检查减少了80%，预计GBCAs排放量将显著减少，这将导致淡水系统中Gd浓度的暂时降低，测量和分析这种瞬态Gd信号可提高人们对环境系统的认识，并为自来水厂有关外源或病原体输入的风险评估提供更好的数据[40]。未来，由于MRI的不断增加，水环境中GBCAs浓度可能继续升高，尽管实际增加的GBCAs浓度很低，但污水处理工艺对饮用水中GBCAs的影响将会引起环境工作者的关注。

2 生物毒性研究现状

2.1 含钆对比剂与NSF

NSF是被报道的与GBCAs使用有关的疾病，发生在严重肾功能损伤病人注射GBCAs后，目前致病机理仍不明确[41]。2006年Grobner提出NSF可能与GBCAs的使用有关[5]，此后的探究提示了钆与NSF疾病的相关性[42-49]，并在NSF患者的脑部、皮肤、组织及血管等位置检出金属钆。GBCAs的安全性开始受到质疑[50]，美国、欧洲各国以及我国先后出台GBCAs安全使用警示[51-54]。

目前NSF疾病与GBCAs相关性的研究主要分为两部分：GBCAs金属转移分析;金属钆刺激产生NSF疾病的原因。实验分为体外实验和体内实验，动物实验模型包括：细胞模型(主要以成纤维细胞为主)、血液、人皮肤、活体动物模型(以小鼠为主)等[55-70]。Kimura等[55]在体内注射钆双胺(Gd-DTPA-BMA)、Gd-DTPA和钆特酸葡甲胺(Gd-DOTA)，结果显示注射Gd-DTPA-BMA的病人体内Zn的含量最高。Gd-DOTA增加，Zn的排放量不明显，Gd-DTPA增加，有少量Zn的排放，而Cu的排放不受三者影响。Puttagunta等[58]进行Gd-DTPA、Gd-DTPA-BMA等GBCAs体内转化实验，结果证明有金属转移，使用Gd-DTPA-BMA的病人尿液中锌含量显著升高。Tweedle等[59]发现GBCAs在体外可发生金属离子置换，产生游离的钆离子。Telgmann等[60]体外实验评估Gd-DTPA、Gd-DOTA与铁之间的金属离子转移，证明Fe3+与GBCAs在血浆中需较长的时间后发生离子转化，说明GBCAs在肾病病人体内的半衰期较久，导致其与其他金属离子发生转移，产生游离钆离子。Idée和Thakral等[61-62]对与GBCAs相关的金属转移研究进行总结，提出金属转移产生游离钆是诱发NSF疾病的可能作用机制。病人肾功能受损无法将GBCAs完全排除，当造影剂的半衰期超过30 h后，“螯合Gd”与“游离Gd”之间的平衡被破坏，使Gd3+被其他金属离子置换，从螯合形态解离出来。游离的Gd3+与血浆中的物质结合，从而刺激NSF疾病产生[61]。

在探求钆造成纤维化的诱导机制方面，主要从GBCAs对成纤维细胞造成增殖、对胶原蛋白产生影响[63-66]以及对免疫细胞造成刺激等领域展开[67-69]。Edward等[63]发现GBCAs可诱导成纤维细胞产生过量的乙酰透明质酸和胶原蛋白，并刺激纤维细胞生长。Varani等[64]发现人皮肤在钆双胺的刺激下胶原蛋白并无显著变化，但基质金属蛋白酶(MMP)及组织抑制剂(TIMP-1)增加；钆双胺处理下的成纤维细胞出现细胞增殖并伴随MMP及TIMP-1增加。同时，GBCAs浓度不同，对成纤维细胞功能作用发生变化，浓度过高时将抑制部分纤维细胞增殖及相应金属蛋白酶较少。而Perone等[66]发现GBCAs虽然对胶原蛋白含量并无影响，但胶原分解活性受到影响。且胶原的分解活性与TIMP-1有关，当TIMP-1高达250 ng/mL时观察到胶原在细胞层中沉积的增加。证明GBCAs加入后导致TIMP-1增加，同时导致胶原降解活性降低，胶原更新减少并易形成胶原蛋白沉淀损害细胞。

关于GBCAs对免疫细胞作用的研究，Vakil等[68]发现钆双胺干扰单核细胞对纤维细胞分化的信号调节，从而造成纤维化，说明NSF的发病机理可能由于GBCAs影响纤维细胞分化的辅助因子。Newton等[69]通过研究GBCAs刺激下的免疫细胞以及成纤维细胞炎症变化，解释游离钆离子刺激促炎和纤维化反应过程，即GBCAs产生游离钆离子，刺激单核细胞、巨噬细胞和炎症小体等免疫细胞产生炎症反应，从而导致纤维化。Schmidtlauber等[70]使用酶联免疫法(ELISA)、蛋白质印迹法和实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法对钆刺激下小鼠内NLRP3炎症小体和IL-1β白细胞介素含量进行分析，发现钆离子及钆双胺均可激活NLRP3并诱导IL-1β产生。说明GBCAs会诱发炎症小体产生炎症反应，从而诱导纤维化。

2.2 含钆对比剂NSF以外的毒理学终点

目前，GBCAs暴露与毒理学终点(严重肾损害患者的NSF除外)之间的关系数据有限。由于NSF病人的增多，非NSF病人在使用GBCAs(特别是多次使用)后的临床症状及毒性研究开始受到关注[71]。近年来，提出了一种新的病理——钆沉积病(GDD)[72]。尽管GDD的病理生理机制、危险因素，甚至作为一种疾病都存在争议，但GDD已广泛受到关注。虽然GBCAs相对稳定，但有报道发现GBCAs在体内可分解，使得Gd元素在动物或非NSF病人组织及器官沉积、富集，甚至组织学改变，包括脑组织(特别是齿状核和苍白球)、骨头、皮肤、肝脏等，多次使用GBCAs的病人Gd累积现象更甚[73-80]。Gd在部分组织的沉积是长期的，在骨头沉积甚至长达8年以上[81]。

GBCAs具有肾毒性，体外实验证实其可导致肾小管细胞坏死和凋亡[82]；对比猪注射GBCAs与注射含碘造影剂后的影响，GBCAs显示出更强的肾毒性[83]；Akgun等[84]报道了一位56岁肾功能正常的女性患者连续2次注射GBCAs进行核磁成像检查，几天后病人出现急性肾功能衰竭，肾活检显示急性肾小管坏死。

GBCAs毒性不限于肾毒性。在GBCAs治疗的小鼠中观察到肝、肺和肾组织的组织病变和分子凋亡[85]。Blasco-Perrin等[86]报道一位58岁女性在核磁共振检查中使用GBCAs诱发复发性急性胰腺炎(最初给药3 h后)。另一病例报告显示GBCAs给药后出现胰腺炎[87]。一名45岁无症状女性在使用GBCAs进行头颅MRI检查4 h后出现上腹部疼痛和呕吐，腹部症状出现12 h后，发现严重坏死性胰腺炎。

GBCAs证实具有潜在神经毒性。Ray等[88]报道将钆喷酸二甲胺注射到雄性大鼠侧脑室后产生了急性神经毒性(肌阵挛、共济失调、震颤、胼胝体出血和损伤)。Hui等[89]报道了一名接受GBCAs核磁共振成像的妇女脑病的发展，质谱法检测到病人脑脊液样本中含有23 000 nmol/mL的钆。

以往的致病机理和毒性研究从分子生物学或临床症状角度出发，缺乏体内钆形态的直接证据。本课题组选择NIH-3T3细胞作为Gd暴露实验和Gd结合蛋白鉴定的模型，通过多种分析手段分离鉴定出微管蛋白是NIH-3T3细胞中一种新的Gd结合蛋白，并通过生物实验证实Gd与微管蛋白的结合能抑制微管蛋白的聚集或解聚，提示Gd3+与微管蛋白结合干扰微管的形成可能是Gd毒性的重要分子机制[90]。

3 分析方法

3.1 检测方法

目前在GBCAs的环境行为及毒性研究中，采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、X射线荧光光谱法(XRF)对Gd元素总量进行检测仍是主要手段[91]。Gd元素总量在一定程度上可间接反映GBCAs在环境以及生物组织中的分布、迁移、转化，但不能获得GBCAs的形态转化、代谢及其与其他物质的相互作用等具体信息，因此，对具体GBCAs的检测变得尤为重要。GBCAs具有水溶性强、结构多样的特点，针对其中1种或多种GBCAs检测的方法种类较多，目前国内外报道的检测方法主要分为色谱类方法、电泳类方法、辐射类方法及联用类方法。色谱类方法包括高效液相色谱法(HPLC)、尺寸排阻色谱法(SEC)、离子色谱法(IC)；电泳类方法包括毛细管电泳法(CE)、毛细管区带电泳法(CZE)、胶束电动毛细管电色谱(MEKC)；联用类方法包括高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、毛细管电泳-质谱法(CE-MS)、高效液相色谱-电感耦合等离子体发射光谱法(HPLC-ICP-OES)、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(HPLC-ICP-MS)等(见表2)。

表2 不同类型样品中含钆对比剂的分析方法Table 2 Analytical methods for GBCAs in different type of samples

(续表2)

GBCAs的研发过程中，由于Gd3+具有较强的毒性，需对GBCAs进行稳定性研究，HPLC成为主要的方法之一。由于稳定性研究无需对不同的GBCAs进行同时测定，目标物单一，液相色谱柱多采用反相C18[59,92-97]或C8[95,98-99]色谱柱。同时,GBCAs可配制成相对较高浓度的溶液，一般采用紫外可见检测器检测。部分Gd络合物具有荧光响应(如Gd-DOTA)，可在280 nm下激发，316 nm波长处检测[93]。在HPLC分离检测某些GBCAs时，由于目标物易电离，需加入离子对试剂(四丁基氢氧化铵)加强目标物在反相柱上的保留(如Gd-BOPTA2-)[95]。稳定性研究实验中，由于GBCAs的分子量较大，因此可采用尺寸排阻色谱柱将Gd3+与GBCAs分离，可同时测定GBCAs和解离的离子[101]。由于GBCAs极性很强，在反相色谱柱上的保留较差，分析多种GBCAs时会出现共流出现象，为提高多种GBCAs同时测定时的色谱分离度，近年来多采用亲水作用色谱柱进行分离。本课题组、Maia等[114-115]采用化学计量学手段对HPLC分离条件进行优化，实现了1种或多种GBCAs的最优化分离。由于部分GBCAs为离子型化合物，因此可采用离子色谱[111,115]、毛细管电泳、毛细管区带电泳[102,108,110]进行分离，该类方法对于非离子型GBCAs难以分离。为同时检测离子型和非离子型GBCAs，Andrasi等[109]采用MEKC法分离检测了6种GBCAs，该方法可直接进样检测，适合临床样品GBCAs的快速检测。

HPLC法的灵敏度较低，检出限较高，一般在μmol/L级。由于环境中GBCAs的含量相对较低，而在研究生物代谢动力学时亦需要更灵敏的方法，因GBCAs含有Gd元素，可通过将分离方法与高灵敏元素检测方法联用以改善GBCAs的方法检出限，HPLC-ICP-OES[105]和HPLC-ICP-MS因此应运而生[101,103,111-113,115]，检出限可达nmol/L或亚nmol/L级。获得更低检出限的另一选择是采用液相色谱-质谱联用法，检出限可至nmol/L或亚μmol/L级，视目标GBCAs的可电离程度而异。本课题组[115]对比了HPLC-ICP-MS、HPLC-MS和IC对于7种GBCAs的检测能力，GBCAs在ESI的电离差异较大，HPLC-ESI-MS的检出限较HPLC-ICP-MS高1～2个数量级，而IC仅能分析其中4种离子型化合物，因此HPLC-ICP-MS在多种GBCAs同时检测时具有较大优势，可适用于低含量GBCAs的环境、生物应用。但其仍具局限性，由于使用HILIC或反相色谱柱分离，流动相含有高含量乙腈或甲醇，对联用的ICP-MS仪有硬件要求，需配备小内径中心管的炬管、有机加氧装置及半导体制冷装置，相应的仪器调谐也需在有机进样模式下进行。CE与MS联用也可提高方法灵敏度，检出限可达亚μmol/L级，但仅局限于部分GBCAs。

3.2 样品前处理

目前所报道的检测GBCAs的样品类型分为两类：一类为水样，包括地表水、污水、自来水等；另一类为生物样品，主要为血样和尿样，包括血浆、血清、全血等。第一类样品基质相对简单，且GBCAs水溶性强，样品经过滤后可直接进样。对于含量极低的水样，有报道通过红外烘烤的方式进行浓缩富集。第二类样品因富含大量蛋白质、有机物等基质，多采用沉淀蛋白后，离心过滤进样分析。

目前研究涉及的样品类型均集中于上述两类样品，因此所涉及的样品前处理技术相对简单。随着含钆对比剂毒性和环境风险评价的进一步开展，更多样品类型被关注，针对不同类型的样品特性，将会开发更多的样品前处理方法以适应检测需求。

4 结论及展望

GBCAs的使用量日益增长，因其具有很高的亲水性，在污水处理厂不能很好被去除而轻易地进入环境。由于GBCAs与NSF疾病密切相关，同时已被证实具有神经毒性、肾毒性、导致组织病变等毒性，进入环境的GBCAs成为新型污染物。各国先后在环境中检出GBCAs，但其环境归趋、转化、生态毒性等信息鲜少，因此开展GBCAs的环境、生态、毒理、健康风险研究意义重大，而准确可靠的分析方法是开展相关工作的重要保障。GBCAs的分析方法以色谱法及色谱与其他检测技术联用法为主，其中，基于亲水色谱分离的HPLC-ICP-MS法因具有良好的选择性、准确性及灵敏度，成为GBCAs分析的首选方法。

今后GBCAs的相关研究可考虑从以下3方面进行：①目前所报道的检测方法多针对水样、血样、尿样等液体样品，相应的前处理方法简单，但由于环境中部分GBCAs的含量极微，目前的检测方法仍未满足要求，应关注针对沉积物、不同类型生物组织等复杂基质样品的前处理方法，以减少基体效应、富集浓缩超低含量GBCAs；②目前GBCAs的环境归趋、转化、生态毒性信息较少，可开展相关方面研究；③GBCAs暴露与毒理学终点之间的关系数据有限，相关机理尚未明确，可通过建立多种分析方法相结合的检测系统，结合生物学研究手段，揭示相关毒性机理。