表面等离子体共振传感器生物识别分子的固定化方法

万 红，赵 钊，梁花蕾，崔海容，刘虎威

（武昌理工学院 生命科学学院，湖北 武汉 430223）

表面等离子体共振（Surface plasma resonance，SPR）是一种光学生物传感技术［1］，当光从光密介质进入光疏介质时，会发生反射与折射，而SPR共振角度会随着反射光折射率的变化而改变。当偶联在传感芯片表面的生物分子与其它分子发生相互作用时，会引起反射光折射率的改变，通过实时监测SPR共振角的变化，即可记录样品与固定在SPR芯片上的生物识别分子之间的特异性结合情况［2］。SPR具有无需标记样品，样品前处理简单，样品用量少，检测灵敏度高，能实时检测生物分子间的相互作用，并获得分子间结合与解离的信息等优点［3-4］，因而被广泛应用于药物筛选［5-6］、生物检测［7］和食品分析［8］等领域。

构建合适的SPR生物传感界面是提高检测灵敏度和选择性的重要途径。构筑SPR芯片需要考虑如下因素［9-12］：（1）根据生物分子的特性和目标分析物的性质以及二者间的相互作用机理，功能化修饰SPR芯片表面，以固定生物识别分子；（2）功能化的芯片表面须具有生物相容性，以保持固定分子的生物活性；（3）提高生物识别分子的负载量，以增加其与目标分子特异性反应的量；（4）防止芯片表面的非特异性结合，减少其它分子的干扰。

构筑SPR芯片的主要步骤是首先将芯片表面的金功能化修饰，然后通过吸附或化学偶联的方法在金表面固定生物识别分子。生物识别分子与目标分子的相互作用是利用分子中特定的点位或片段与目标分子进行特异性结合。根据生物识别分子的分布和空间取向，生物识别分子的固定方法分为非定向固定和定向固定两种。生物识别分子的非定向固定是指通过化学偶联方法固定在SPR芯片表面的生物识别分子处于随机分布状态，且分子识别片段的取向也是随机的；生物识别分子的定向固定是指通过一定的化学或生物化学反应，使生物识别分子均匀地固定在SPR芯片表面，且分子识别片段的取向一致。

1 基于化学偶联的非定向固定法

1.1 自组装单层膜法

自组装单层膜法（Self-assembled monolayer，SAM）是利用双官能团分子的一端巯基与金的共价键作用，在芯片表面形成有序单分子组装体的方法。双官能团分子的另一端通常为羧基官能团，经碳二亚胺活化后，可偶联生物识别分子［13］。

自组装单层膜法能在金表面形成高度有序且致密的单分子膜，通过调节双官能团分子碳链的长度，可以调控生物识别分子与目标分析物之间相互作用的效果［14］。自组装单层膜的厚度较薄，其优点是对金表面SPR影响较小，但缺点是生物识别分子的负载量较小，检测灵敏度受影响。为克服这一问题，Melaine和Kim等人分别利用单链/双链DNA［15］、抗原/抗体形成的三明治结构［16］，负载纳米金粒子，从而增强SPR信号。

自组装单层膜也可使用巯基化的聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）作为自组装分子。巯基化的聚乙二醇由于具有巯基烷烃的柔性和有序特性，且羟基（—OH）具有亲水性，因此能够有效地固定生物识别分子，被用于构筑SPR芯片的有线性PEG6［17］（图1）、二巯基化PEG（DSPEG2）［18］和羧基功能化的二巯基PEG（S2PEGCOOH）［19］等。

图1 自组装膜法固定生物识别分子示意图［17］Fig．1 Schematic diagram of immobilizing bioreceptor by SAM［17］

为增加表面生物识别分子的负载量，可使用两种或多种自组装分子形成自组装混合膜，以调节膜端基的官能团密度，更多地锚定分子量较大的生物识别分子，从而提高检测的灵敏度［20-21］。

1.2 多维聚合物膜法

如前所述，SPR芯片表面的自组装单层膜有序可控，但生物识别分子的负载量较小。因此，可通过在SPR芯片表面修饰多维聚合物膜来提高生物识别分子的负载量。一些高分子聚合物由于含有多个活性官能团，这些官能团既能在芯片表面形成稳定的薄膜，同时活化后又能偶联生物识别分子，因此在SPR芯片制备中得到广泛的应用。

羧甲基化葡聚糖（Carboxymethyl dextran，CMD）常被用于SPR芯片表面形成多维聚合物膜。CMD分子的终端有许多羧基官能团，活化后可以化学偶联生物识别分子。其负载量比自组装单层膜高，主要原因是CMD分子的羧基官能团与芯片表面的结合位点大大增加［22］。He等［23］用羧甲基葡聚糖在芯片表面制备了多维聚合物。经EDC/NHS（1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride/NHydroxysuccinimide）活化后，固定蛋白偶合物（卵清蛋白）与抗原。由此制备的SPR传感芯片可用于检测生物标志物3-硝基酪氨酸，检测结果表明SPR生物传感器的分析性能比酶联免疫方法更好。Xia等［24］用CMD聚合物修饰的芯片易于同时共价固定2种生物识别分子，且能高效再生；研究表明采用EDC/NHS活化后固定2种抗体，可同时检测牛奶和血清中的庆大霉素与三聚氰胺。

由于SPR的感应范围有限，平均穿透深度小于200 nm，灵敏度随着芯片表面膜厚度的增加呈指数级下降，聚合物的使用可能会使芯片表面的基质层厚度达200 nm，从而极大地影响了SPR的分析性能［25］。Wang等［26］比较了SAM和CMD功能化芯片的SPR分析性能，发现SAM功能化芯片具有更高的灵敏度，主要原因是SAM膜更薄，金表面的SPR响应信号更强。

聚多巴胺（PDA）薄膜也广泛应用于制备SPR生物传感器。在弱碱性的水溶液中，多巴胺发生自发聚合反应，能在各种有机和无机基底表面形成稳定的聚多巴胺薄膜。聚多巴胺中的醌基能与生物分子中的胺基或巯基通过迈克尔加成或Schiff碱反应形成共价键，从而固定生物识别分子。Lee等［27］的研究表明，只需将多巴胺溶液滴加在金表面，多巴胺便可实时聚合，聚多巴胺层的厚度可通过改变沉积时间进行控制。此外，端基为胺基的DNA可直接偶联到聚多巴胺膜表面，无需添加额外试剂［28］。Toma等［29］在温和反应条件下，在金芯片表面制备了聚多巴胺薄膜，结果表明在不使用任何偶联试剂的条件下，聚多巴胺薄膜表面可共价偶联抗体，且抗体偶联反应速率较快，并可实时调控（图2）。

图2 聚多巴胺固定生物识别分子示意图［29］Fig．2 Schematic diagram of the PDA immobilization of bioreceptors［29］

与传统SAM耦合方法相比，将抗体固定到聚多巴胺薄膜可增大生物识别分子的负载量，原因是薄膜表面结合位点增加，空间位阻减小，且抑制了EDC/NHS的水解问题［30］。

基于自组装单层膜法和多维聚合物膜法实现功能化的芯片均可偶联DNA、抗体、生物素和蛋白质等生物识别分子，但固定的生物识别分子的取向是随机的，不利于与目标分析分子的有效结合。生物识别分子的定向固定，是使识别分子的取向适合与目标分子结合，从而充分利用芯片表面固定的生物识别分子，提高SPR传感的灵敏度。此外，影响SPR检测选择性的主要因素是检测样品中物质在芯片表面的非特异性吸附。在定向固定法中，芯片表面往往形成的是单分子层膜，且分子取向一致，增加了特异性反应，降低了非特异性吸附，从而提高检测的选择性；非定向固定法中，芯片表面往往形成的是多层膜，且分子取向随机，导致非特异性吸附较强，但检测的选择性较低。因此，生物识别分子的定向固定成为研究热点，也是提高分析灵敏度和选择性的重要途径。

2 基于生物识别分子亲和性的定向固定法

2.1 利用DNA定向固定生物识别分子

巯基化的单链DNA可在SPR芯片的金表面形成自组装膜，然后与生物分子（如抗体、生物素）标记的DNA通过碱基配对互补关系杂交形成双链DNA，从而固定目标生物分子。Ladd等［31］首先在金芯片上用标记生物素巯基烷烃形成自组装膜，然后用亲和素偶联单链DNA，再通过杂交将DNA标记的人绒毛膜促性腺激素抗体固定在SPR表面（如图3A），由此制备的SPR芯片对人绒毛膜促性腺激素的检出限为0．5 ng/mL。Bombera等［32］设计并构建了一种用于细胞实时分选的DNA-DNA-抗体SPR生物芯片，研究了定向化的分子和细胞之间的相互作用。Leroy等［33］采用DNA定向偶联抗CD19和抗CD90IgG，分别捕获B淋巴细胞和T淋巴细胞，使用限制性内切酶切割DNA-蛋白偶联物，监测细胞的释放（如图3B）。

DNA与低分子量抗原偶合物也可用于构建SPR生物传感器，Tort等［34］将类固醇半抗原-DNA偶合物，通过基因杂交偶联至SPR芯片表面，实验结果表明其对抗血清（As147、As170和As138）有较好的识别作用（如图3C）。

DNA折纸是指通过长的单链DNA支架，与数百条与之互补配对的短链DNA相互配对后，折叠成一定形状，具有很好的生物相容性的DNA微观结构。这种DNA微观结构不仅能定向固定生物识别分子，而且可以形成生物识别分子阵列，大大提高芯片表面的负载量。利用DNA折纸技术［35］，将结合凝血酶的核酸适配体定向固定至DNA微观结构中，检测凝血酶的量可低至6．1 nmol（如图3D）。

图3 DNA定向构建SPR芯片Fig．3 SPR chips constructed by DNA-directed immobilization

2.2 利用蛋白A/G定向固定生物识别分子

蛋白A（Protein A）来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，含有多个可与免疫球蛋白（IgG）分子的Fc段特异性结合的结构域。蛋白G（Protein G）是从G类链球菌中分离出的胞壁蛋白，不仅可结合IgG的Fc段，还能结合IgG的Fab段，对于大多数哺乳动物的IgG有着更高的亲和力。在芯片表面先用巯基羧酸自组装膜，再用EDC/NHS试剂活化羧基，然后通过偶联的方法将免疫球蛋白固定在芯片表面，得到的免疫球蛋白的特异位点是随机分布的。如果活化羧基后，先偶联蛋白G［36］，再固定人体生长激素免疫球蛋白，便可实现免疫球蛋白的定向固定，使芯片表面固定的人体生长激素抗体增加2．6倍。为了有效地克服芯片在洗涤过程中抗原/抗体的离解，使用化学交联剂交联抗原/抗体后，可使人体生长激素抗体的检测灵敏度增加3．5倍。Paiva等［37］用二硫化碳作为交联剂与蛋白A的胺基相联，通过硫元素与金表面形成共价键固定蛋白A。另外加入纳米金，可以负载更多的蛋白A。用蛋白A固定IgG能够使IgG的结合位点取向一致，二硫化碳还起到防止IgG非特异性吸附的作用（如图4），可使检测抗体的量增加2．6倍。

图4 二硫化碳功能化蛋白A定向固定受体示意图［37］Fig．4 Schematic diagram of functionalization of protein A with carbon disulfide and direct immobilization of the receptor［37］

值得注意的是，由于蛋白A和蛋白G作用于免疫球蛋白分子特异性结合的结构域，将会影响抗原、抗体的相互作用，从而影响检测的灵敏度。

2.3 利用“点击化学”定向固定生物识别分子

“点击化学”（Click chemistry）的代表反应是由叠氮化物和炔烃作用形成共价键。该反应条件温和，特异性高，稳定性好，甚至能在活细胞中进行，且能保持生物分子的生物活性。Van't Veer等［38］研究发现，将叠氮基团引入重链抗体分子中，然后在芯片表面引入环辛炔，通过铜（Ⅰ）催化叠氮化物-炔烃环发生加成反应后，再将重链抗体定向固定在芯片表面，制备的SPR芯片检测灵敏度可提高10倍以上（见图5）。为消除催化剂铜（Ⅰ）盐对生物分子的毒性，避免生物分子因结构改变而失活，可在无铜条件下实现点击化学。Trilling等［39］用含叠氮基团的青霉素结合蛋白质（Penicillin-binding proteins，PBPs），通过叠氮化物-炔烃环加成反应，将PBPs均匀地固定在二苄基环辛炔涂层表面，结果显示，定向固定的PBPs仍保持生物活性，与特异性蛋白结合后SPR信号显著增强。

图5 叠氮修饰重链抗体分子固定示意图［38］Fig．5 Schematic diagram of orientation of immobilized VHHs with tailor-made modifications［38］

2.4 利用氨基三乙酸定向固定生物识别分子

氨基三乙酸（Nitrilotriacetic acid，NTA）可用于蛋白质定向固定化，其原理是NTA分子和金属离子（如Ni2+、Co2+、Zn2+、Cu2+）之间形成4配位的螯合物，螯合物中金属离子的另2个游离态结合位点与六组氨酸（Hexa-histidine，His6）标记蛋白质的2个连续的组氨酸形成配位键。His6是融合重组蛋白纯化和检测的常用标签，可重组到蛋白质中的特定位置，因此可在SPR芯片表面均匀地定向固定His6标记蛋白，用于分子识别。Wasserberg等［40］重组了带有His6标签的红色荧光蛋白（TagRFP），用（His6）-Ni2+∶NTA方法在芯片表面固定TagRFP（图6）。结果表明，固定在芯片表面的TagRFP稳定性增加了1个数量级，且所有TagRFP生物活性位点的取向一致。由于蛋白质的3D空间结构较为复杂，带有1种His6标签的蛋白质可能因NTA螯合物锚点较少而不够稳定，无法确保蛋白质在表面定向固定。因此，可在蛋白质分子中引入多个His6标签，但要注意引入的几个His6标签必须结合在特定位置，因此对于蛋白质结构的设计要求更高。

图6 NTA定向固定生物受体示意图［40］Fig．6 Schematic diagram of NTA strategy for oriented immobilization of bioreceptors［40］

为增加蛋白质配位复合物的稳定性，His6标记蛋白质可附着在羧甲基化葡聚糖膜上，并使用交联剂固定，使用此方法可获得稳定的高密度定向生物识别分子的SPR芯片。用固定His6标记的人碳酸酐酶检测药物4-羧基苯磺酰胺，检出限为14 nmol/L，具有较高灵敏度［41］。

为提高在SPR生物传感芯片上固定His6标记蛋白质的均匀性和负载量，可使用其他NTA复合物。如将三氨五乙酸硫醇（DPTA）或甲苯二吡咯硫醇（DPM）与形成铜（Ⅱ）的配合物自组装至SPR金芯片表面，可实现His6标记的Janus激酶2（GST-His6-JAK2）的定向固定［42］。实验结果表明，与用DPTACu（Ⅱ）定向固定蛋白相比，用DPM-Cu（Ⅱ）配合物定向固定的GST-His6-JAK2蛋白的动力学和热力学参数均有较好的提升，主要原因是DPM的空间位阻更小。

3 结论与展望

利用表面化学原理和纳米技术设计与制备功能化的芯片，定向固定生物识别分子，是提高SPR生物传感器检测灵敏度和选择性的有效途径。将来应努力开发通用的定向固定方法，以广泛应用于不同的SPR传感器。

（1）将氧化石墨烯等2D纳米材料应用于SPR生物传感器的研究取得了一些进展［43-44］，但局限于增加芯片表面立方体空间，需引入纳米金粒子，以增强SPR响应。要进一步开发各种2D纳米材料，修饰芯片表面，以增加定向固定化生物识别分子的负载量，提高检测的灵敏度。

（2）利用蛋白本身的结构特性，开发出针对特定类别的蛋白固定技术。如针对常见的带有组氨酸残基的蛋白，捕获镍离子常用的配体是三齿配体氨基三乙酸［45-46］，有关二齿配体亚氨基二乙酸的报道并未应用于SPR技术中，而一般认为由于二齿配体相对于三齿配体的空间位阻较小，在蛋白固定中可能会表现出独特的优势。

（3）利用生物技术，如定点突变、从头设计、蛋白质融合等重组蛋白［47-48］，在生物识别分子表面引入固定化基团，达到一步定向固定生物识别分子的目的。

总之，SPR技术的发展不仅使人们能高效快速地筛选药物，研究生物分子的相互作用，而且有可能提供更灵敏的环境污染物监测、癌症标志物监测和食品安全分析方法。在SPR传感芯片上有效固定生物分子是一个重要的研究领域。我们相信，随着各种固定化技术的完善及新技术的出现，SPR技术必将得到更快的发展，为科学研究和社会经济发展提供更强大的分析手段。