核酸介导蛋白质共价修饰的研究进展

杨 雯，李婧影，杨黄浩

（教育部食品安全与生物学分析科学重点实验室，能源与环境光催化国家重点实验室福州大学化学学院 福建 福州 350108）

蛋白质是细胞中含量最丰富的生物分子。天然的蛋白质翻译后修饰大大拓展了蛋白质结构的多样性，从而使蛋白质的功能增加了两个数量级［1］。人工蛋白质标记物对于现代医学和许多生物技术至关重要，但一个关键的挑战是合成均质和位点特异性的偶联物。为此，科学家们开发了一系列人工蛋白质共价修饰的策略。为了保持蛋白质的生物活性，蛋白质修饰策略通常需要满足以下5个条件［2］：（1）蛋白质修饰的化学反应必须耐受生物环境条件（pH 6~8，≤37℃，水性溶剂）；（2）不同于有机合成反应的标准条件（通常使用数十或数百mmol/L浓度的底物），体外和体内应用时蛋白质浓度通常为μmol/L级别或以下，这可能造成反应动力学障碍；（3）保护基团是传统有机化学中实现化学选择性合成的有力工具，但保护基团可能会影响蛋白质中活性氨基酸的功能，因此不能普遍使用；（4）在许多情况下，需要选择性地将探针修饰到特定氨基酸上，产生结构明确的偶联物；（5）在复杂拥挤的生物环境中修饰蛋白质，还必须考虑修饰策略的蛋白质选择性。

最初的蛋白质修饰策略是通过将蛋白质暴露于亲电试剂中实现。例如将n-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）酯用于蛋白质共价修饰。NHS酯与蛋白质表面不同的亲核基团反应，其中最重要的是赖氨酸残基。由于大多数蛋白质表面赖氨酸的丰度高，该反应通常会产生异质修饰蛋白质［1］。因此，为了以可控的方式修饰蛋白质以获得均质的蛋白质修饰产物，近几十年开展了多种修饰策略。目前的主要策略之一是在蛋白质的一级结构中引入叠氮化物、烯烃、炔烃等修饰的非天然氨基酸。然而，这类策略操作繁琐，且修饰效果因不同蛋白而异［3］。此外，通过优化反应试剂还可实现选择性地与蛋白质的某个氨基酸残基反应，例如磺酰基丙烯酸选择性靶向单个赖氨酸残基，磺基苯并噻吩靶向半胱氨酸残基等［4］。

除了蛋白质中氨基酸反应位点的选择性，提高复杂环境中兴趣蛋白（Proteins of interest，POI）的选择性有助于共价修饰策略在生物领域的进一步应用。这类策略主要依靠POI与配体相互识别驱动的邻近效应来提高反应动力学和选择性（图1），其分子探针主要包含三部分：用于识别POI的配体，用于与蛋白质发生共价反应的基团和用于检测或进一步调控蛋白功能的报告基团［5-6］。其中，核酸介导的蛋白质共价修饰策略被广泛用于POI选择性修饰，并被应用于适配体筛选、药物筛选、蛋白质相互作用研究、蛋白糖基化检测等领域。核酸具有易合成、热稳定性好、高度可编程、易于修饰等优点，在某些“辅因子”的存在下还可以发挥催化性能［7］。因此，核酸介导的蛋白质共价标记策略近十年来受到科学家们的广泛关注。本文根据标记探针所用的导向配体分类，综述了核酸介导的蛋白质共价标记策略的发展及应用。

图1 核酸介导蛋白质共价修饰策略示意图Fig．1 Scheme of nucleic acid-mediated protein covalent modification

1 小分子作为配体导向的核酸介导蛋白质共价修饰策略

2013年，Li团队［8］在核酸介导蛋白质共价标记领域做了开创性工作，将这种策略命名为“DNA编程的光亲和标记（DNA-programmed photoaffinity labeling，DPAL）”（图2A），并在策略优化和应用方面做了一系列工作。DPAL是一种简单、模块化和多路复用的方法，通过DNA模板化学可对蛋白质进行光亲和性反应标记。这种方法中，特异结合POI的小分子修饰在模板DNA上组成结合探针（Binding probe，BP），光交联基团双吖丙啶和一个信号标签被结合到互补DNA的两端，构成捕获探针（Capture probe，CP）。结合探针首先与POI结合，随后加入捕获探针，结合探针与捕获探针互补杂交，在紫外光照射下携带光交联基团的捕获探针与POI共价偶联。作者以三种POI混合物（亲和素、碳酸酐酶和胰蛋白酶以1∶1∶1物质的量比混合）和人宫颈癌细胞系HeLa的细胞裂解液作为模型，证明了DPAL在复杂环境中的靶标识别和修饰能力，为准确鉴定小分子结合蛋白提供了一种有价值的工具［8］。然而，双吖丙啶与大多数蛋白的光交联效率较低（仅为2%~8%），限制了DPAL在低丰度和低亲和力蛋白中的应用［9］。为了提高探针交联效率，Li团队［9］在多种基团中筛选出叠氮苯作为新的光交联基团，其交联效率可达18．9%。此外，光交联效率可随着捕获探针偶联的叠氮苯数量增加而增加，偶联叠氮苯数量为4时交联效率可达38．3%（图2B）。值得注意的是，这种多价的光交联探针上叠氮苯数量不影响DPAL的POI选择性。

对于已知的配体和POI，DPAL可应用于检测仅有一个结合表位的蛋白质。例如Li团队［10］在后续研究中将其用于检测亲和素，检出限可达4 nmol/L，且在复杂的细胞裂解液中仍显示出出色的目标特异性。作者还将此方法拓展用于检测叶酸受体、血小板生长因子和凝血酶［10］。该团队还进一步通过设计捕获探针的DNA序列长度，将DPAL用于检测组蛋白脱乙酰酶（HDAC）的关联蛋白，发现了传统亲和探针无法获得的间接HDAC结合蛋白，并揭示了HDAC相关蛋白的新的生物学意义（图2C和图2D）［11］。这为表征蛋白质之间的相互作用提供了一种广泛适用的简单方法。

图2 （A）DPAL示意图［8］；（B）多价光交联探针用于DPAL示意图［9］；（C）多个CP在BP上的不同位点杂交，捕获蛋白质复合物中的直接和间接偶联蛋白［11］；（D）光交联剂在CP中可以是突出的（n＞0）或隐性的（n＜0）配置，L：一个已知的配体；星号：光交联剂［11］Fig．2（A）Scheme of DPAL［8］．（B）Scheme of multivalent photoaffinity probe for DPAL［9］．（C）Multiple CP hybridize at different sites on BP for capturing the direct and indirect binders in protein complex［11］．（D）CP may have a“protruding”（n＞0）or“recessive”（n＜0）configuration．L：a known ligand；star：photo-crosslinker［11］

准确鉴定具有生物活性的小分子的靶标蛋白是生物医学研究中一个非常重要且具有挑战性的任务。许多具有生物活性的小分子往往不止一个靶点，DPAL方法可作为生物活性小分子靶标蛋白鉴定的有效工具。Li团队［12］采用DPAL方法鉴定一种高度特异性的极光激酶A（Aurora kinase A，AKA）抑制剂Alisertib的靶标。其中，Alisertib是一种具有抗癌活性的临床候选药物。除了已知的AKA靶标外，还证实Alisertib与p38丝裂原活化蛋白激酶和层粘连蛋白受体具有相互作用，其抗癌活性可能与此有关。这项工作有助于从分子层面理解Alisertib作为临床候选药物的疗效和副作用。此外，得益于DPAL在复杂环境中的靶点选择和共价结合能力，Li团队［13-14］将其用于未固定和未纯化蛋白质配体的筛选，并通过筛选得到了活细胞上叶酸受体、碳酸酐酶12和活细胞上的表皮生长因子受体的一系列新型配体［15］。这些结果证明DPAL在活细胞膜蛋白配体筛选中的广泛使用性，有助于膜蛋白为靶点时药物的发现。

金属蛋白占所有天然蛋白的三分之一以上，参与了许多重要的生理功能。为了进行金属蛋白的共价标记，Gothelf团队［16］开发了一种基于氨三乙酸（Nitrilotriacetic acid，NTA）修饰的DNA模板指导的共价偶联（DNA-templated protein conjugation，DTPC）策略（图3A）。NTA可为金属离子提供四个配位键，具有强络合能力，能与各种金属离子形成稳定的螯合物。三价NTA修饰的DNA模板链引导活化的NHS酯修饰的互补DNA链靠近金属结合位点附近的Lys，随后发生共价反应，生成共价DNA-金属蛋白产物。DTPC策略成功应用于His标记的重组绿色荧光蛋白和天然金属结合蛋白血清转铁蛋白的共价修饰。作者还利用该策略通过恒域组氨酸簇标记IgG1抗体。然而，由于NHS酯易水解的固有性质，标记探针的保存和处理条件要求严格。此外，由于NHS的固有反应性，需将蛋白控制在低浓度以防止随机交联。为了解决这些问题，Gothelf团队［17］将互补DNA链的共价反应基团改为醛基，从而允许在更高浓度下进行目标蛋白的标记。

随后，Gothelf团队［18］将DTPC策略应用于制备抗体-药物的偶联物，并用于抗癌药物在活细胞中的靶向递送。首先将表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）抗体西妥昔单抗偶联到DNA上，随后通过双链DNA与阿霉素（DOX）的相互作用形成抗体-化学药物偶联物（图3B）。偶联物中的DNA双链作为阿霉素的载体，西妥昔单抗作为靶向剂，提高阿霉素对癌细胞的递送效率并降低其全身毒性。作者通过对比两株EGFR+细胞株（人口腔表皮样癌细胞系KB和人乳腺癌细胞系MDAMB-231）和一株EGFR-细胞株（小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3），研究了偶联物的体外细胞毒性和选择性杀伤癌细胞的能力。结果显示在EGFR过表达细胞系中，抗体-化学药物偶联物比游离阿霉素的细胞毒性更强，这表明偶联物具有良好的靶细胞选择性。DTPC策略为DNA-蛋白质偶联提供了一种便捷有效的途径，并为抗体-化学药物的开发提供了新思路。

图3 （A）DTPC策略介导修饰His6标记的绿色荧光蛋白［16］；（B）通过DTPC制备西妥昔单抗-DNA偶联物，并将DOX嵌入偶联物的示意图［18］Fig．3（A）DTPC mediated coupling of an activated ester to His6-tagged green fluorescent proteins［16］．（B）Schematic illustration of preparation of the cetuximab-DNA conjugate by DTPC and intercalation of DOX into the complex［18］

2 多肽作为配体导向的核酸介导蛋白质共价修饰策略

根据类似的原理，多肽也被用于辅助核酸介导的蛋白质共价修饰。组蛋白翻译后修饰（Histone posttranslational modifications，HPTMs）是染色质基因表达的遗传和表观遗传调控的关键决定因素。因此，鉴定这些组蛋白的相互作用蛋白对于理解潜在的基因表达和表观遗传的调控机制至关重要。然而，由于与HPTMs的相互作用短暂、亲和力低，分析这些相互作用蛋白仍是一项挑战。Zhang团队［19-20］报道了利用DPAL标记和富集组蛋白相互作用蛋白的双探针（图4A）。通过使用包含HPTMs的多肽修饰的结合探针和双吖丙啶修饰的捕获探针，将低亲和力和动态的HPTMs相互作用转化为稳定的共价相互作用，为HPTMs图谱分析提供了一种新的化学蛋白质组学研究工具。此外，Gothelf团队［21］开发了一种肽引导靶向识别的核酸介导蛋白质共价标记策略，用于组装人造免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）。在这项工作中，小FC-III K肽与结合探针结合，引导捕获探针接近POI并共价偶联。该反应可以在复杂的生物环境如细胞裂解液中成功执行。作者进一步设计和制备了由5个DNA-利妥昔单抗偶联物构建的星形五聚DNA抗体纳米结构。透射电镜分析表明其拓扑结构和尺寸与天然IgM相似（图4B），从而为人造IgM提供了新思路。然而，可能是受限于多肽-蛋白质配对的种类和数量，截止目前，利用多肽作为配体导向的核酸介导蛋白质共价修饰策略的研究较少。

图4 （A）DPAL用于HPTM相互作用蛋白的鉴定［19］；（B）典型的单一伪IgM结构（i）及野生型IgM结构（ii）的透射电镜图［21］Fig．4（A）Identification of HPTM reader proteins by DPAL［19］．（B）TEM images of representative single pseudo IgM structures（i）and wildtype IgM（ii）［21］

3 适配体作为配体导向的核酸介导蛋白质共价修饰策略

适配体是具有特殊分子、细胞甚至组织选择性的单链DNA或RNA序列，主要通过非共价相互作用识别各种靶点。它通常由配体指数富集系统进化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）方法筛选得到，可用于生物传感、生物成像、细胞信号转导调制、疾病诊断和治疗［22］。然而，由于适配体与靶标之间不稳定的非共价相互作用，脱靶效应时有发生，这使得在复杂环境下的适配体-靶标复合物纯化和提取变得困难。为了克服这一瓶颈，Famulok团队［23］开创了一种通用策略，命名为基于适配体的亲和标记（Aptamer-based affinity labeling，ABAL），用于复杂样本中适配体目标的识别（图5A）。在ABAL中，光反应性叠氮苯基和生物素共同修饰在适配体序列的5′端，其中叠氮苯基起交联剂作用，生物素标记作为信号基团标记适配体-蛋白质缀合物。适配体识别POI后，叠氮苯基在紫外光照射下与蛋白发生共价反应，从而使适配体和POI稳定结合。作者分别在血液、细胞裂解液和活细胞中采用三种不同的适配体-蛋白对验证了ABAL的可行性。Yang团队［24］开发了一种类似的光亲和探针策略，利用双吖丙啶作为交联剂，用于目标蛋白-适配体特异性偶联。类似地，Tan团队［25］以氟修饰羧基作为交联剂成功进行了适配体和特异性蛋白的偶联。基于此，Zhang团队［26］开发了一种适配体探针分析组蛋白H4适配体结合域。该探针包含组蛋白H4特异性识别的DNA序列、用于光交联的叠氮苯基、用于亲和富集交联产物的生物素标签，以及用于从交联产物中分离组蛋白的可切割二硫基。作者成功地实现了组蛋白H4的特异性富集，并进一步开发了一种新的组蛋白适配体相互作用的分析策略，首次对组蛋白H4与适配体的结合区域进行了研究和讨论。该策略显示出巨大的潜力，可有助于理解组蛋白与DNA的相互作用模式。

此外，Bertozzi团队［27］开发了一种基于适配体邻近增强生物正交反应的活细胞特定蛋白糖基化类型检测策略（图5B）。在这一策略中，细胞预先通过糖代谢标记使蛋白上的特定糖基携带叠氮基团，随后进行二苯并环辛（DBCO）修饰的适配体偶联。通过质谱、蛋白免疫印迹和流式细胞术验证了酪氨酸蛋白激酶-7受体和B细胞受体的重链的糖基类型，并首次证明酪氨酸蛋白激酶-7含有唾液酸化类型的糖基。此策略为验证特定蛋白的糖基化提供了一种有力的工具。随后，Tan团队［28］在适配体和DBCO之间引入一个光可裂解的邻硝基苄苯基团，通过紫外照射裂解邻硝基苄苯基团，随后通过互补DNA杂交去除适配体，并重复此过程，实现对特定蛋白的多色成像和细胞表面纳米工程的多重修饰。除了用于检测和成像，Tan团队［29］还在活癌细胞上选择性识别和偶联治疗性适配体，以提高抗癌治疗的效率和准确性。该工作将免疫检查点拮抗适配体共价结合在癌细胞表面，实现有效和持续的免疫检查点封锁治疗，显著延长了小鼠的整体生存时间。

图5 （A）基于适配体的亲和标记原理示意图：与靶蛋白孵育后，紫外光照使适配体与靶蛋白交联。随后，用链霉亲和素修饰的磁珠孵育，得到纯化适配体蛋白复合物［23］；（B）在活细胞表面特定蛋白糖基化类型检测的示意图：用5′端和3′端分别带有DBCO和报告基团的适配体处理细胞。核酸适配体结合使DBCO优先结合到同一糖蛋白上邻近的叠氮标记的唾液酸残基［27］Fig．5（A）Principle of aptamer-based affinity labeling．After incubation with its target protein，UV light is used to cross-link the aptamer to its target．Subsequent incubation with streptavidin-coated magnetic beads allows purification of the aptamer-protein complex［23］．（B）A chemical strategy for the selective labeling of protein glycoforms on live cell surfaces．Azide group labeled cells are treated with a functionalized aptamer bearing a DBCO and a reporter group on the 5′and 3′termini，respectively．Aptamer binding positions the DBCO to ligate preferentially to SiaNAz residues in proximity on the same glycoprotein［27］

不同于直接在适配体上修饰交联剂的蛋白修饰策略，Zhang团队［30］开发了一种以DNA为模板的适配体探针，用于鉴定适配体的靶标蛋白（图6A）。与DPAL类似，该探针由包含适配体的结合探针和含双吖丙啶的捕获探针组成。这类探针的交联剂不直接修饰在适配体序列上，从而降低了对适配体构型的影响。作者以溶菌酶作为模型，证明该策略可用于复杂和真实环境下目标蛋白的精确识别。无独有偶，Tan团队［31］选择NHS脂作为反应基团构建了相似的探针，并证明了这种探针可用于活细胞膜蛋白共价标记。本课题组结合DNA为模板的适配体探针和糖代谢标记，开发了一种DNA为模板的糖基标记策略，并将其应用于活细胞膜受体的空间分布成像（图6B）［32］。蛋白质印迹结果说明DNA探针共价标记在目标受体的糖基上，最大限度地减少了对内源性受体固有结构和功能的干扰。由于寡核苷酸具有精确的可编程性和功能灵活性，选择性DNA标记可直接应用于其他场景，如操纵受体空间分布和生物功能。总之，这种受体特异性结合策略将极大地推动受体的动态和功能研究，并有助于理解受体在其自然环境中的生物学机制。

图6 （A）基于DNA模板化学和光交联技术的适配体探针用于溶菌酶检测示意图［30］。步骤1：结合探针与溶菌酶共孵育；步骤2：加入捕获探针使其与结合杂交形成复合物；步骤3：紫外光照射引发光交联反应；步骤4：标记荧光基团或生物素用于凝胶成像或产物富集；步骤5：质谱分析；（B）用于监测活细胞中特定受体空间分布的DNA模板化糖基标记策略示意图［32］。步骤1：糖代谢标记细胞；步骤2：结合模块（Binding moiety，BM）：操作模块（Handle moiety，HM）识别特定受体并共价偶联；步骤3：加入CDNA通过链置换反应将BM从特定受体移除Fig．6（A）Schematic representation of aptamer probe for lysozyme detection based on DNA templated chemistry and photo crosslinking technology［31］．Step 1：incubation of aptamer with lysozyme．Step 2：the addition of CP probe to initiate BP/CP hybridization．Step 3：UV-irradiation to initiate photo-crosslinking．Step 4：the labeling with a fluorophore or biotin for in-gel imaging or enrichment．Step 5：MS analysis；（B）Schematic illustration of a DNA-templated glycan labeling strategy for monitoring specific receptor spatial distribution in living cells［32］．Step 1：metabolic oligosaccharide engineering of cells．step 2：BM∶HM recognition then conjugation．Step 3：BM removing via strand displacement reaction with the CDNA

除了作为POI的靶向配体和引导共价交联的模板，核酸还可与辅因子结合作为共价标记反应的催化剂。G-四联体/氯高铁血红素（Gq/h）是一种核酸结构增强的氧化物酶模拟物，近两年被应用于蛋白质催化标记。Oyoshi课题组［33］开发了一种以Gq/h作为模拟酶、n-甲基鲁米诺衍生物作为底物，对G-四联体结合蛋白进行邻近标记的技术（图7A）。作者证明可在牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA）的干扰下特异性标记RNA G-四联体TERRA的结合蛋白UP1，并确定标记位点是结合位点附近的Y167酪氨酸残基。此外，作者还对HeLa细胞裂解液进行标记和nanoLC-MS/MS分析，表明RNA结合蛋白得到显著的富集，并鉴定出一些此前未报道的G-四联体结合蛋白。这些结果表明，该G-四联体蛋白邻近标记技术有望用于识别未知的G-四联体结合蛋白。此外，Albada课题组［34］观察到G-四联体序列和折叠构象与蛋白质修饰效率的相关性，其中氯高铁血红素与平行的G-四联体序列结合比与反平行的G-四联体序列结合具有更高的催化活性。作者还通过结合DNA链置换反应赋予Gq/h的蛋白催化标记反应可编程和可操控的性质。

不同于直接利用Gq/h标记G-四联体的结合蛋白，本团队发展了一种以适配体和Gq/h为基础的非基因工程探针Apt-Gq/h，并用于在活细胞中标记POI的潜在相互作用蛋白（图7B）［35］。在Apt-Gq/h中，核酸适配体作为将探针特异性结合到目标蛋白的“锚”，从而使Gq/h邻近催化标记反应的POI范围大大拓展。同时，Gq/h作为催化剂，在H2O2活化下快速氧化带生物素标签的苯酚底物转化为高反应活性的苯氧基自由基。苯氧基自由基的半衰期短（＜1 ms）、扩散半径小（＜20 nm），仅与目标蛋白附近20 nm内蛋白质上的富电子氨基酸发生共价反应，从而使潜在的相互作用蛋白带上生物素标签。收集这些标记的蛋白并进行蛋白质组学分析，即可得到关于POI的蛋白质相互作用网络。作者利用这种探针研究了间质表皮转换因子受体的蛋白微环境，为蛋白质相互作用研究提供了一种有潜力的工具。

图7 （A）（i）具有过氧化物酶活性的氯高血红素催化标记血红素蛋白示意图［33］；（ii）平行构象的G-四联体与氯高血红素结合，使其过氧化物酶活性增强，G-四联体氯高血红素复合物能选择性标记G-四联体结合蛋白［33］；（B）核酸探针用于邻近标记示意图Fig．7（A）（i）Hemin-catalyzed protein labeling hemeprotein based on peroxidase activity of hemin［33］．（ii）Peroxidase activity of hemin is increased by the binding with parallel G-quadruplex structural DNA or RNA．Proximity labeling around the G4-hemin complex enables selective labeling of G4-binding proteins［33］．（B）Schematic illustration of the nucleic acid tool for proximity labeling［35］

4 结论

蛋白质是自然界中重要的生物分子，选择性的蛋白质化学修饰为从分子层面研究生理机制和靶向药物开发提供了强有力的技术支持。我们以导向的配体分类，回顾了核酸介导蛋白质共价修饰的各种策略。这些策略的成功，得益于核酸固有的特性：（i）核酸作为天然存在的生物大分子，其生物相容性佳；（ii）核酸探针通过固相合成法制备，易于添加修饰基团，便于商业化销售；（iii）具有可精准设计和编程的特性，可以灵活设计多种探针；（iv）特殊序列的功能核酸具有特异性识别或催化的特性。因此，核酸在这类策略中可作为配体实现共价修饰的选择性，作为模板辅助反应基团与蛋白质靠近，还可作为催化剂增强邻近区域的蛋白质修饰反应。

一方面，核酸介导的蛋白质共价修饰策略的应用方向受导向的配体种类影响。共价修饰策略将不稳定和动态的配体-靶标相互作用改变为稳定的共价结合作用，大大降低了POI本身的复杂性、动态特性以及生物系统的复杂性。因此，小分子和核酸适配体作为配体导向的修饰策略用于鉴定各自的作用靶点，或筛选针对特定POI的小分子药物或适配体。如何发现有效和特定的配体结合的生物靶标是化学的一个关键问题，这与药物开发密切相关，因此也是未来核酸介导蛋白质共价修饰策略的重点应用方向之一。另一方面，核酸介导的蛋白质共价修饰策略用于丰富POI的可操纵性，例如构建人造IgM、抗体-化学药物和研究生物系统中蛋白质的相互作用等。生物系统中蛋白质的相互作用研究有助于从分子水平理解各种疾病的发生和发展，照亮药物开发中寻找POI的道路。然而，不论是哪种配体导向的核酸介导蛋白质共价修饰策略，都基于配体-蛋白质识别从而拉近反应基团距离，提高有效反应浓度这一基本原理，并不能完全杜绝非特异性蛋白的共价修饰。因此，共价反应基团是影响修饰策略POI选择性的重要因素，也是未来发展修饰策略的重点研究方向。我们相信，随着蛋白质选择性修饰策略的发展，必将产生新的基础生物学知识和和治疗应用。